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。2022年4月7日；79(5):228.
doi:10.1007/s00018-022-04248-8。

AUF1通过调节NRF2和ATF3保护铁下垂减轻脓毒症诱导的急性肺损伤

王宜春 # 1, 陈迪宇（Diyu Chen） # 2, 韩雪（Han Xie） 三, 贾明旺 4, 孙晓芳 三, 方鹏 4, 郭菲菲 4, 道林堂 5
附属公司

AUF1通过调节NRF2和ATF3保护铁下垂减轻脓毒症诱导的急性肺损伤

王宜春等。 细胞分子生命科学。 。

摘要

背景：富AU元素（ARE）结合因子1（AUF1）作为感染性休克的开关，尽管其潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们研究了AUF1在脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）中调节铁凋亡的生物学意义和潜在分子机制。

方法：采用铁下垂诱导化合物攻击肺泡上皮细胞（AECs）和盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的ALI分别作为体外和体内模型。采用环己酰亚胺追踪分析和联合免疫沉淀法检测AUF1的稳定性及其通过泛素蛋白酶体途径的降解。通过RNA免疫沉淀（RIP）、RNA下拉和mRNA稳定性分析，探讨AUF1对核因子E2相关因子2（NRF2）和激活转录因子3（ATF3）的调节。在功能上，通过测量细胞活力、脂质过氧化、铁蓄积和总谷胱甘肽水平，评估改变AUF1、NRF2或ATF3对AECs或ALI小鼠铁下垂的影响。

结果：在mRNA和蛋白质水平上，AUF1在受到铁凋亡诱导化合物攻击的AEC中下调。E3泛素连接酶FBXW7负责AUF1在铁凋亡过程中的蛋白质降解。通过上调NRF2和下调ATF3，AUF1在体外拮抗AECs的铁凋亡。在CLP诱导的ALI模型中，AUF1基因敲除小鼠的存活率显著降低，肺损伤加重，这与肺铁沉降增强有关。

结论：FBXW7介导AUF1在铁凋亡中的泛素化和降解。AUF1通过相反调节NRF2和ATF3对抗铁凋亡。激活AUF1通路可能有助于治疗脓毒症诱导的ALI。

关键词：ATF3；AUF1；FBXW7；铁下垂；NRF2；脓毒症诱导的ALI；无所不在。

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数字

图1
图1
泛素-蛋白酶体途径介导AECs在铁凋亡期间AUF1降解。AEC用伊拉斯汀（5μM）、索拉非尼（10μM），RSL3（10μM）或柳氮磺胺吡啶（20μM）治疗12小时。通过MTT法测定细胞活力来评估铁下垂(A类)，BODIPY染色(B类)，细胞内MDA(C类)，铁(D类)和总谷胱甘肽E类水平。F类通过RT-PCR检测对照组或Erastin治疗的AEC中铁凋亡相关标记物GPX4、ACSL4、SLC7A11和SLC11A2的表达水平。G公司在对照或Erastin处理的AECs中通过RT-PCR检测指示的RBP的表达水平。H（H）通过western blot检测用Erastin、Sorafenib、RSL3或磺胺嘧啶处理的AEC中AUF1的蛋白水平。我通过CHX追踪试验检测AUF1蛋白的降解，其中AEC用CHX（5μg/mL）处理指定的时间段。使用抗AUF1抗体用Co-IP检测AUF1的泛素化，用MG-132（25μM）阻断AECs的蛋白酶体信号2 h后，用Erastin（5μM）、Sorafenib（10μM）或RSL3（10μM）处理AECs 12 h(J型); 在用MG-132（25μM）阻断AECs蛋白酶体信号2小时后，用Erastin（5μM）处理AECs指定的时间段（K）；AEC用伊拉斯汀（5μM）、不含或含利普司他丁-1（25 nM）或铁抑素-1（100 nM）治疗12 h后(L（左）). *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
图2
图2
E3泛素连接酶FBXW7在铁凋亡过程中负责AUF1的降解。A类网络显示AUF1（HNRNPD）的潜在E3泛素连接酶，如使用UbiBrowser数据库预测的那样(网址：http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/ubibrower/). 较粗的线表示较高的似然比。B类通过RT-PCR比较对照组和Erastin处理的AECs（Erastin在5μM下持续12 h）之间FBXW7、MDM2和STUB1的表达水平。C类用Co-IP检测FBXW7和AUF1之间的相互作用，使用对照组和Erastin处理的AECs（Erastin，5μM，12 h）中的抗FBXW6抗体。IgG抗体作为阴性对照。D类表达对照shRNA（shNC）或四种不同shRNA靶向FBXW7（shFBXW7-1至-4）的慢病毒被转导到AEC中48小时。非转导AEC被用作对照。western blot检测FBXW7蛋白水平。E类,F类western blot检测AUF1的表达E类和RT-PCRF类在对照中，shNC-或shFBXW7转染的AECs用或不用Erastin（5μM，12小时）攻击。G公司在MG-132预处理（25μM，2 h）后，使用对照组、shNC或shFBXW7输注AECs的抗AUF1抗体，通过Co-IP检测AUF1的泛素化*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001.不另说明。不重要
图3
图3
AUF1拮抗伊拉斯汀诱导的铁下垂。A类将AUF1-过度表达和控制载体慢病毒转导到AECs中48小时。western blot检测AUF1蛋白水平。B类——F类通过MTT法测定细胞活力来评估铁下垂(B类)，细胞内铁(C类)，BODIPY染色(D类)、MDA(E类)和总谷胱甘肽F类载体或AUF1过度表达的AEC中的水平受到或没有Erastin的挑战（5μM持续12小时）。G公司通过RT-PCR检测GPX4、ACSL4、SLC7A11和SLC11A2在载体或AUF1过度表达AEC中的表达水平，这些AEC受到或不受到Erastin的攻击（5μM持续12小时）。H（H）GPX4和SLC7A11的表达水平通过蛋白质印迹在用或不用Erastin（5μM，12小时）攻击的载体或AUF1过表达的AECs中检测*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
图4
图4
AUF1通过上调NRF2减轻铁下垂。A类通过western blot检测载体中NRF2和HO-1的表达水平，或用或不用Erastin（5μM，12 h）攻击AUF1过度表达的AECs。B类通过RT-PCR检测载体或AUF1过度表达AEC中NRF2的mRNA水平，这些AEC用或不用Erastin（5μM，持续12 h）攻击。C类用抗AUF1抗体RIP法检测AECs中AUF1与NRF2 mRNA的结合。IgG作为阴性对照。D类通过RNA下拉法检测AUF1与CDS的结合以及NRF2 mRNA的3'-UTR。E类用放线菌素D（2.5μg/mL）处理载体或AUF1过度表达的AECs指定的时间段，并在指定的时间点测定NRF2 mRNA。F类——J型通过MTT法测定细胞活力来评估铁下垂(F类)，细胞内铁(G公司)，BODIPY染色(H（H）)、MDA(我)和总谷胱甘肽J型AUF1过度表达和/或NRF2被敲除48小时后，指示细胞中的水平，然后用或不用Erastin（5μM，12小时）攻击细胞。K（K）AUF1过度表达和/或NRF2被敲除48小时后，通过western blot检测GPX4和SLC7A11在指示细胞中的表达水平，然后用或不用Erastin（5μM，12小时）攻击细胞*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
图5
图5
AUF1通过下调ATF3来预防脱铁性贫血。（A-B）用western blot检测ATF3的表达水平A类和RT-PCRB类载体或AUF1过度表达的AEC受到或不受到Erastin的攻击（5μM持续12小时）。C类用抗AUF1抗体RIP法检测AECs中AUF1与ATF3 mRNA的结合。IgG作为阴性对照。D类通过RNA下拉法检测AUF1与ATF3 mRNA 3'-UTR的结合。E类用放线菌素D（2.5μg/mL）处理载体或AUF1过度表达的AEC达指定时间段，并在指定时间点测定ATF3 mRNA。F类——J型通过MTT法测定细胞活力来评估铁下垂(F类)，细胞内铁(G公司)，BODIPY染色(H（H）)、MDA(我)和总谷胱甘肽J型AUF1和ATF3后指示细胞中的水平在48小时内过度表达，然后用或不用Erastin（5μM，12小时）攻击细胞。K（K）AUF1和ATF3过度表达48 h后，通过western blot检测GPX4和SLC7A11在指示细胞中的表达水平，然后用或不用Erastin（5μM，12 h）攻击细胞*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
图6
图6
铁中毒损伤介导体内败血症诱导的ALI。预先给假手术或CLP手术小鼠注射或不注射铁抑制素-1（1 mg/kg体重，连续两天腹腔注射；n个 = 20/组）。A类使用Kaplan–Meier方法测定各组小鼠的存活率。CLP手术后24小时，B类各组肺组织代表性HE图像，比例尺：100μm；C类对各组肺损伤进行评分并进行比较；D类——E类TUNEL染色检测肺组织细胞死亡；F类——G公司ELISA法检测血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6F类和BALFG公司指定小鼠组；H（H）——M（M）对指定组的肺组织进行肺W/D重量比测量(H（H）)，MPO活动(我)，BALF中的单元格总数(J型)，铁(K（K）)，总谷胱甘肽(L（左）)和MDA(M（M）)水平*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
图7
图7
AUF1耗竭加重CLP诱导的肺损伤。对AUF1野生型（WT）或敲除型（KO）小鼠（n=20/组）进行假手术或CLP手术。A类使用Kaplan–Meier方法测定各组小鼠的存活率。手术后24小时，B类各组肺组织代表性HE图像，比例尺：100μm；C类对肺损伤进行评分，并在指示组之间进行比较；D类——E类ELISA法检测血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6D类和BALFE类指定小鼠组；F类——H（H）对指定组的肺组织进行肺W/D重量比测量(F类)，MPO活动(G公司)和BALF中的总单元格(H（H）). *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
图8
图8
AUF1缺失加剧了CLP诱导的肺组织铁下垂。对AUF1野生型（WT）或敲除型（KO）小鼠进行假手术或CLP手术(n个 = 20/组）。手术后24小时，A类——C类对指定组的肺组织进行铁测定(A类)，总谷胱甘肽(B类)和MDA(C类)层次；D类——E类RT-PCR检测肺组织中GPX4、ACSL4、SLC7A11和SLC11A2的表达水平D类和western blot(E类);F类——G公司western blot检测肺组织中NRF2和ATF3的表达水平F类和RT-PCR(G公司). *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001
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