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.2022年3月3日；79(3):170.
doi:10.1007/s00018-022-04168-7。

MicroRNA-24-3p通过调节HMGA1促进骨骼肌分化和再生

帕罗米塔·戴伊 1, 迈尔斯·A·索耶 1 2, 比扬·K·戴 三 4
附属公司

MicroRNA-24-3p通过调节HMGA1促进骨骼肌分化和再生

帕罗米塔·戴伊等。 细胞分子生命科学. .

摘要

许多研究已经确定了microRNA在不同生物过程中调节转录后基因表达的关键作用。在此，我们报道了miR-24-3p在骨骼肌分化和再生中的作用和机制。miR-24-3p通过直接靶向高迁移率组AT-hook 1（HMGA1）并调节其及其直接下游靶点分化抑制剂3（ID3），促进成肌细胞分化和骨骼肌再生。在新生小鼠中，miR-24-3p基因敲除通过解除Hmga1和Id3的表达增加PAX7阳性增殖性肌干细胞（MuSCs）。同样，抑制胫骨前肌中的miR-24-3p可防止Hmga1和Id3下调并损害再生。这些发现为体内MuSC分化和骨骼肌再生需要miR-24-3p/HMGA1/ID3轴提供了证据。

关键词：发展；区别；HMGA1；Id3；成肌细胞；再生；骨骼肌干细胞；miR-24-3p；微RNA。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
miR-24-3p在成人骨骼肌中大量表达，并在成肌细胞分化和肌肉再生过程中上调。A类qRT-PCR分析显示miR-24-3p在小鼠原代成肌细胞分化过程中上调。miR-24-3p值首先归一化为U6sn值，并测定miR-24-3 p相对于未分化成肌细胞（GM）的折叠变化。DM1、DM2和DM3表示成肌细胞在分化培养基（DM）中培养的天数。BmiR-24-3p在成人骨骼肌中大量表达。使用不同的小鼠组织进行qRT-PCR以测量miR-24-3p。这些值被归一化为相应的U6sn值，再次归一化成骨骼肌的值。C在肌肉注射CTX造成的损伤后第1、3、5、7和14天，对非注射对照组的胫骨前（TA）肌横截面进行苏木精和伊红（H&E）染色。D类miR-24-3p在损伤后第1-3天下调，在损伤后5-14天上调。这些值表示为三个值的平均值±SD(A类——B)和五个(D类)生物复制
图2
图2
miR-24-3p促进原代成肌细胞分化，并且是其所必需的。A类用GL2或miR-24-3p每隔24小时转染原代成肌细胞2次，然后用DM替换GM。用DM替换GM24和48小时后分别对这些细胞进行MYOG和MHC免疫染色。BMYOG-和MHC-阳性细胞的分数相对于GL2（NC）为100%。C 米格和Mhc公司mRNA水平Myog公司和Mhc公司，并且将值标准化为Gapdh公司，然后再次设置为NC值。D类MYOG、MHC和GAPDH蛋白水平。GAPDH起到了装载控制的作用。E类每隔24小时用GL2（Ant-NC）或miR-24-3p（Ant-24）特异性抗戈米转染原代成肌细胞两次，然后用DM替换GM。用DM替换GM24和48小时后分别对这些细胞进行MYOG和MHC免疫染色。F类MYOG和MHC阳性细胞的级分相对于Ant NC对照以100%表示。G公司qRT-PCR用于米格和Mhc公司，并且将值标准化为C.H（H）MYOG、MHC和GAPDH蛋白水平。GAPDH起到了装载控制的作用。数值表示为生物三倍体的平均值±SD*P（P） < 0.001
图3
图3
miR-24-3p通过直接靶向和调节促进成肌细胞分化赫姆加1.A类microRNA靶点预测程序miRanda预测miR-24-3p结合位点嗯，13英尺UTR。恒星表示突变的碱基（PRL-A1Mut）。B进行荧光素酶分析，以测量miR-24-3p转染对融合到野生型和突变型的Renilla（rr）荧光素酶报告子的影响嗯，13′UTR（PRL-A1和PRL-A1-Mut）。共转染萤火虫荧光素酶质粒作为转染对照。用对照rr荧光素酶质粒对rr/pp值进行标准化嗯，13′UTR（PRL），在GL2转染细胞（NC）中相对于归一化rr/pp值表达。C当NC或miR-499与PRL-A1构建物共同转染时，荧光素酶活性也进行了类似的测定。D类将NC或突变形式的miR-24-3p（miR-24Mut）与PRL或PRL-A1共同转染，并同样测定荧光素酶活性。E类,F类miR-24-3p外源性表达下调嗯，1mRNA和蛋白质水平。G公司,H（H）Ant-24持续表达嗯，1mRNA和蛋白质水平。我空逆转录病毒载体（EV）或在缺乏其3′UTR（HMGA1-3′UTR）或与其连接的3′UTR（HMGA1+3′UTR）的成肌细胞中稳定表达HMGA1的逆转录病毒载体中的HMGA1水平。J型稳定表达EV的成肌细胞及其缺乏或含有嗯，13'UTR分化3天。显示HMGA1、MYOG、MHC和GAPDH蛋白水平。GAPDH起到了装载控制的作用。（K） 这些细胞上的MHC免疫染色。数值表示为生物三倍体的平均值±SD*P（P） < 0.001
图4
图4
敲除miR-24-3p可增加体内PAX7-阳性增殖MuSCs。A类腹腔注射Ant-24降低新生儿骨骼肌内源性miR-24-3p。miR-24-3p的qRT-PCR值归一化为U6sn值，表示为相对于Ant-NC值。miR-192被用作NC。BAnt-24去压机嗯，1和识别码3转录水平。的qRT-PCR嗯，1和识别码3后腿骨骼肌归一化Gapdh公司，然后再次发送到相应的Ant-NC样本。C从Ant-24注射新生小鼠分离的MuSC中miR-24-3p水平降低。D类Ant-24或Ant-NC注射新生儿BrdU标记后4小时采集的骨骼肌共焦图像。细胞增殖用抗BrdU抗体（绿色）测定，细胞表面用LAMININ（红色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）复染。E类每个场的相对BrdU阳性核。五只小鼠10个随机场的平均值±SD。F类Ant-24注射新生儿骨骼肌的共焦显微镜图像D类对BrdU（绿色）、PAX7（红色）、DAPI（蓝色）、BrdU和PAX7，以及BrdU、PAX7和DAPI（洋红色）进行免疫染色。五只新生小鼠样品的平均值±SD*P（P） < 0.001. 比例尺：50μM
图5
图5
miR-24-3p对骨骼肌再生至关重要。A类 赫姆加1伤后1-3天TA肌肉逐渐上调，伤后5-14天下调。嗯，1值被标准化为13卢比值。B我们在CTX损伤后第3天将荧光（DyLight594）偶联Ant-24注射到成年小鼠的TA肌肉中，并在损伤后第5天采集样本。Ant-24在损伤后第5天结合到TA肌肉中，包括MuSC。箭头表示PAX7-阳性MuSC的子集与Ant-24荧光重叠。C从这些样品中分离出的MuSC中miR-24-3p水平也降低。对miR-24-3p进行qRT-PCR，其值首先归一化为U6sn值，然后再次相对于NC值进行归一化。D类,E类伤后第3天在TA肌肉内注射Ant-NC和Ant-24。miR-24-3p水平受到抑制，并且嗯，1和识别码3伤后第5天，TA肌肉中的转录水平被解除。嗯，1和识别码3将值标准化为各自的13卢比值，然后再次转换为Ant-NC值。F类——我在损伤后第7天和第14天，miR-24-3p水平仍然受到抑制，并且嗯，1和识别码3Ant-24样本中的转录水平仍处于下降状态。J型H&E染色的代表性图像显示Ant-24在损伤后第7天和第14天损害再生。K（K）,L（左）使用斐济软件在第14天对再生纤维进行DESMIN和LAMININ染色和横截面积（CSA）。从这两组五只小鼠的十个随机切片中统计了600多条纤维。比例尺：50μM。五只小鼠样品的平均值±SD*P（P） < 0.001; **P（P） < 0.01
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