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.2022年3月；298(3):101644.
doi:10.1016/j.jbc.2022.101644。 Epub 2022年1月28日。

HBXIP是一种新的未折叠蛋白反应调节器，可维持ER+乳腺癌患者对三苯氧胺的耐药性

张胜宏 1, 王冉冉 1, 王欣悦（Xinyue Wang） 1, 郭雪玲 1, 杜燕燕 2, Xin Guo公司 三, 总新兰 1, 朱长辉 1, 周晓蕾 4
附属公司

HBXIP是一种新的未折叠蛋白反应调节因子，在ER+乳腺癌中维持他莫昔芬耐药性

张胜宏等。 生物化学杂志. 2022年3月.

摘要

内分泌治疗耐药雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌细胞在不利条件下通常表现出增强的维持内质网（EnR）稳态的能力。癌蛋白乙型肝炎X相互作用蛋白（HBXIP）是一种已知的促进癌症发展的转录辅活化因子。然而，目前尚不清楚HBXIP是否参与维持EnR稳态和促进ER+乳腺癌的耐药性。在此，我们报告了三苯氧胺耐药（TmaR）乳腺癌细胞HBXIP的表达增加，HBXIP作为未折叠蛋白反应（UPR）的灭活剂，以减少三苯氧酚诱导的EnR应激。我们发现，HBXIP缺乏促进了EnR相关的降解，增强了UPR元件报告基因活性和细胞氧化应激，并最终在体外和体内减弱了TmaR细胞的生长。从机理上讲，我们证明HBXIP作为UPR传感器肌醇需要酶1a的伴侣，并减少TamR乳腺癌细胞中活性氧（ROS）的产生。HBXIP表达缺失后，三苯氧胺治疗过度激活IRE1α及其下游促凋亡通路，同时诱导细胞内ROS的积累。这种升高的ROS通过PKR-like ER激酶和激活转录因子6α介导程序性激活UPR的其他两个分支。临床研究和Kaplan-Meier绘图仪分析表明，HBXIP在TamR乳腺癌组织中高度表达。此外，在三苯氧胺单药治疗ER+乳腺癌患者中，HBXIP表达增强与高复发率和低无复发生存率有关。这些发现表明HBXIP是EnR稳态的调节器，也是TamR乳腺癌治疗的潜在靶点。

关键词：HBXIP；乳腺癌；内质网应激；三苯氧胺抗性；未展开的蛋白质反应。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1
图1
HBXIP诱导ER+乳腺癌细胞对TAM的耐药性。A类HBXIP转录活性的启动子活性测定、RT-PCR和免疫印迹分析(上部面板); mRNA表达和蛋白质表达(下部面板)在TamR细胞及其亲本细胞中。B类增加TAM剂量对TamR乳腺癌细胞和HBXIP缺陷细胞的抑制特性。计算TAM的IC50值。C类稳定的HBXIP敲除（通过shHBXIPa和shHBXIPb的两个shRNAs）TamR细胞、稳定的重组HBXIP Tam R细胞和对照细胞的生长能力。D类，显示了裸鼠解剖肿瘤的照片(上部面板). 图中显示了移植有稳定HBXIP敲除和重建TamR细胞的裸鼠肿瘤的平均体积(下部面板). 误差条表示学生评估的±SD值t吨测试。所有实验至少进行了三次。乙型肝炎X相互作用蛋白；TAM，三苯氧胺；TamR，抗他莫西芬。
图2
图2
HBXIP缺乏导致内质网扩张和IRE1α-Xbp1通路激活。A类用1μM TAM或5μg/ml Tm处理稳定的HBXIP敲除TamR细胞和对照细胞后的透射电镜。扩张的ER标记为红线.N，细胞核；比例尺，2μm。面积（像素/ER）通过NIH ImageJ软件进行量化。B类在稳定敲除和/或重组HBXIP的TamR乳腺癌细胞中瞬时表达CD3δ-YFP。免疫印迹分析在1μM TAM处理下转染后48小时CD3δ-YFP的蛋白水平。C类如图所示，稳定的HBXIP敲除TamR细胞和对照细胞与UPRE-luciferase报告系统和/或pCMV-HBXIP载体共同转染。转染2天后，用1和5μM TAM处理细胞48 h，并测定荧光素酶活性。D类如图所示，野生型MEF和HBXIP敲除MEF与UPRE-luciferase报告系统和/或pCMV-HBXIP载体共同转染。转染48 h后，用150和450 ng/ml Tm处理显示的MEF 6 h，并测量荧光素酶活性。E类，RT-PCR分析表达Xbp1u公司和Xbp1型经1μM TAM治疗后，稳定的HBXIP击倒TamR癌细胞中的mRNA和HBXIP表达重建细胞。F类，的表达式Xbp1u公司mRNA和Xbp1型用150 ng/ml Tm治疗后，MEF中的mRNA、HBXIP敲除和HBXIP表达重建了MEF。G公司经1 mM 4-PBA（或载体）处理的天然TamR细胞和稳定HBXIP敲除TamR的细胞的生长能力。误差条表示学生评估的±SD值t吨测试。所有实验至少进行了三次。乙型肝炎X相互作用蛋白；IRE1α，需要肌醇的酶1a。
图3
图3
HBXIP缺乏刺激癌细胞中UPR的三个臂。A类，qPCR定量了UPR相关基因mRNA的表达(ERdj4号机组,第58页IPK公司,EDEM公司、和PDIA6公司)在稳定的HBXIP击倒TamR乳腺癌细胞和用1μM TAM处理的对照细胞中48小时。B类免疫印迹检测ERdj4、p58的表达IPK公司稳定的HBXIP击倒TamR乳腺癌细胞和用1μM TAM处理48小时的对照细胞中的EDEM和PDIA6。C类1μM TAM治疗48小时后，稳定HBXIP敲除和控制TamR癌细胞中IRE1α通路的激活。D类1μM TAM治疗后48小时，稳定HBXIP敲除和控制TamR癌细胞中PERK通路和ATF6α的激活。E类，在1μM TAM处理48小时后，稳定的HBXIP敲低和HBXIP重建的TamR乳腺癌细胞中IRE1α、PERK和ATF6α的激活状态。误差条表示学生评估的±SD值t吨测试。所有实验至少进行了三次。乙型肝炎X相互作用蛋白；TAM，三苯氧胺；TamR，抗他莫西芬。
图4
图4
HBXIP通过与IRE1α的连接域结合来灭活IRE1。A类通过对IRE1α、PERK和ATF6α的免疫印迹分析TamR乳腺癌细胞及其共沉淀物中内源性HBXIP的免疫沉淀。B类，使用GST-IRE1cyto（465-977 AA）和His-HBXIP融合蛋白通过GST下拉分析确定HBXIP和IRE1α之间的相互作用。C类用抗Flag和抗HBXIP Western blotting分析HBXIP缺失和重组TamR乳腺癌细胞及其共沉淀物内源性IRE1α的免疫沉淀。D类，IRE1α结构示意图。E类，各种IRE1α突变体结构如所示D类和HA-HBXIP在HEK293细胞中瞬时表达，蛋白用抗-HA琼脂糖免疫沉淀，沉淀用抗Flag Western blotting分析。F类各种HA标记的HBXIP突变体和Flag-IRE1α在HEK293细胞中瞬时表达，蛋白用抗Flag琼脂糖免疫沉淀，沉淀用抗-HA-Western blotting分析。G公司MCF-7和T47D细胞按指示用剂量递增的TAM处理12 h，并进行免疫印迹以确定IRE1α和HBXIP表达的激活(上部面板). 用抗HBXIP抗体对等分的细胞蛋白提取物进行免疫沉淀。通过对IRE1α的免疫印迹分析沉淀物。HBXIP的Western blotting作为负荷控制(下部面板).H（H）MCF-7和T47D细胞按指示用剂量递增的Tm处理12 h，并进行免疫印迹以确定IRE1α和HBXIP表达的激活(上部面板). 用抗HBXIP抗体对等分的细胞蛋白提取物进行免疫沉淀。通过针对IRE1α的免疫印迹分析沉淀物。HBXIP的Western blotting作为负荷控制(下部面板).我在稳定的HBXIP击倒MCF-7/TAM细胞和对照细胞中内源性HBXIP的免疫沉淀，并通过免疫印迹法对HBXIP和Bip的沉淀进行分析。所有实验至少进行了三次。乙型肝炎X相互作用蛋白；TAM，三苯氧胺；TamR，抗他莫西芬。
图5
图5
HBXIP通过调节细胞内ROS调节PERK和ATF6α通路的激活。A类如图所示，1μM TAM处理增加时间后，免疫印迹分析稳定HBXIP击倒MCF-7/TAM细胞中UPR三臂的激活状态。B类和C类，使用DCFH-DA的流式细胞术分析显示TAM处理细胞中的细胞内ROS水平，如A类.D类Western blot分析1μM TAM处理后用HBXIP N112A突变体重建的HBXIP缺陷MCF-7/TAM细胞中UPR三个分支的激活状态。E类和F类，使用DCFH-DA的流式细胞术分析显示TAM处理细胞中的细胞内ROS水平，如D类.G公司，免疫印迹分析NAC处理对HBXIP N112A突变体重建的MCF-7/TAM HBXIP缺陷细胞中UPR三臂失活的影响。误差条表示学生评估的±SD值t吨测试。所有实验都至少进行了三次。乙型肝炎X相互作用蛋白；TAM、他莫昔芬。
图6
图6
HBXIP的高表达是TMA单药治疗乳腺癌患者复发的促进因素.A类Kaplan–Meier绘图仪在线资源对TAM仅治疗ER+乳腺癌患者的无复发生存分析。根据HBXIP表达水平（logrank第页 = 0.00088).B类HBXIP低表达的代表性免疫组织化学（IHC）图像(弱)和高表达(强大)在9例TAM单药ER+乳腺癌原发组织和复发组织中。C类，原发组织和复发组织的HBXIP mRNA表达水平如B类经qPCR检测。乙型肝炎X相互作用蛋白；TAM、他莫昔芬。
补充图S1–S6
补充图S1–S6
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参考文献

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