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.2021年9月15日12:730434。
doi:10.3389/fimmu.2021.730434。 eCollection 2021年。

基于生物膜培养外膜囊泡的百日咳候选疫苗

弗朗西斯科·卡里奎里博德 1, 巴勃罗·马丁·艾斯普罗 1, 尼古拉斯·安布罗西斯 1, 尤金妮娅·苏里塔 1, 丹妮拉·波特罗 1, 玛丽亚·艾米莉亚·盖拉德 1, 西莉娜·卡斯图玛 1, 埃里卡·鲁迪 1, 阿尼巴尔·洛德里奥 2, Daniela F Hozbor女士 1
附属公司

基于生物膜培养外膜囊泡的百日咳候选疫苗

弗朗西斯科·卡里基里伯德等。 前部免疫. .

摘要

外膜囊泡（OMV）来源于百日咳杆菌-百日咳死灰复燃的病原体在预防免疫小鼠肺部细菌定植方面是安全有效的。含有这些OMV的疫苗配方能够诱导Th1/Th2/Th17混合型，但更有趣的是，它们可能诱导组织-受体记忆免疫反应。这种免疫反应被推荐用于新一代百日咳疫苗，必须开发新一代疫苗来克服当前商业无细胞疫苗（第二代百日疫疫苗）的弱点。第三代百日咳疫苗还应处理由目前在人群中传播的细菌引起的感染，这些细菌的表型和基因特征与过去传播的细菌不同[特别是那些缺乏百日咳抗原PRN（-）表达的细菌]。在这里，我们评估了从生物膜中生长的细菌衍生的OMV的保护能力，因为观察到，通过与旧的培养物收集疫苗株的差异，循环临床百日咳鲍特菌分离株对这种生活方式具有较高的适应能力。因此，我们对具有良好生物膜形成能力的临床分离物进行了研究。扫描电镜和蛋白质组学证实了生物膜的生活方式。虽然扫描电子显微镜显示了这些培养物中典型的生物膜结构，但与浮游培养物相比，BipA、菌毛和其他被描述为典型生物膜生活方式的粘附素在生物膜培养物中过度表达。使用来自生物膜（OMVbiof）或浮游生活方式（OMVplack）的OMV配制疫苗，比较其免疫原性和对PRN（+）或PRN（-）感染的保护能力百日咳鲍特菌临床分离株。使用小鼠保护模型，我们检测到OMV生物疫苗在特异性抗体滴度和质量方面比OMV平板疫苗更具免疫原性，因为OMV生物菌苗诱导的抗体具有更高的亲和力。此外，当OMV以次优剂量给药进行保护时，OMVbiof-疫苗对PRN（+）或PRN（-）的保护能力显著高于OMVplank-疫苗。我们的研究结果表明，疫苗基于百日咳鲍特菌生物膜衍生的OMV也能对缺乏促性腺激素的菌株产生高度保护，具有强大的免疫反应。

关键词：百日咳杆菌；生物膜；外膜小泡；浮游动物；保护；疫苗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
图1
生物膜形成百日咳鲍特菌非生物表面上的Tohama I菌株（灰色柱）和临床分离物BpAR106（黑色柱）。生物膜生物量在生长96小时时通过结晶紫染色进行量化，并在外径595 nm处测量吸光度。每个值表示三个独立实验的平均值，条形图表示标准偏差。临床分离株和B类.百日咳Tohama I生物量吸光度用*表示（p<0.05）。
图2
图2
（A）扫描电子显微镜B类.百日咳生长24小时和96小时时，在非生物表面进行BpAR106生物膜培养。为了通过FEI Quanta 200电子显微镜（24000倍放大）进行观察，样品通过临界点技术进行干燥并涂上金。（B）为了可视化OMV，面板的电子变焦（A）如图所示。白色箭头用于标记OMV的存在。
图3
图3
（A）临床分离物蛋白质样品的火山图B类.百日咳BpAR106在生物膜（Biof）或浮游（Plank）条件下生长-日志10的第页-生物膜和浮游生长条件之间给定蛋白质折叠变化幅度的相关值绘制在纵坐标上，作为对数的函数2横坐标上的褶皱变化。M=对数2（折叠式变换）。过度表达的蛋白质用红色表示（M≥1），而表达不足的蛋白质用蓝色表示（M≤-1），基于第页<0.05. 位于0线上的蛋白质对应于on/OFF蛋白质，因为这些蛋白质没有相关的第页-值。（B）包含在生物膜培养条件下差异表达的蛋白质的不同同源群簇（COG）的表示B类.百日咳BpAR106。在图中，条长度表示总差异表达蛋白中每个COG内过表达（黑色）或低表达（灰色）蛋白的数量。
图4
图4
（A）OMV的SDS-PAGE（12.5%）来源于B类.百日咳在浮游或生物膜培养条件下生长的BpAR106。分子量显示在左侧。（B）OMVplack和OMVbiof悬浮液中的低聚脂质含量由总蛋白质含量归一化。（C）从B类.百日咳BpAR106在浮游或生物膜培养条件下生长（比例尺：200 nm）。
图5
图5
反-百日咳鲍特菌由2剂量疫苗接种计划诱导的抗体。（A）反-百日咳鲍特菌在第二次接种剂量后14天测量IgG滴度和IgG同型。滴度表示为各组数据的几何平均值。（B）在第二次给药14天后，还测量了IgG抗体的亲和力，并用洗脱百分比表示B类.百日咳-用增加浓度的硫氰酸铵（NH）处理后的特异性抗体4SCN）。星号表示具有统计学意义的差异，p<0.05。（C）总蛋白的免疫印迹B类.百日咳用12.5%（w/v）SDS-PAGE分离BpAR106，并用免疫小鼠获得的多克隆抗血清进行检测。血清是根据用于免疫小鼠的OMV疫苗指定的。（D）用12.5%（w/v）SDS-PAGE分离来自这两种培养条件的BpAR106 LOS的免疫印迹，并用免疫小鼠获得的多克隆抗血清进行检测。血清是根据用于免疫小鼠的OMV疫苗指定的。
图6
图6
防止B类.百日咳用OMVbiof或OMVplank基疫苗在小鼠模型中诱导的PRN（-）分离物。对BALB/c小鼠进行两次免疫（i.m），间隔2周。用亚致死剂量（5 x 10）攻击小鼠7CFU/40μl）B类.百日咳BpAR106重氮（+）（A），美国PRN（-）B类.百日咳临床分离物（B）或阿根廷PRN（-）B.百日咳临床分离株（C）第二次接种OMV疫苗后2周。非免疫动物作为保护性阴性对照。对每个菌株/分离物进行了三个独立的实验。给出了一个典型实验的结果。所示结果是各组在激发后7天处死5只小鼠的平均值。虚线表示检测下限。从小鼠肺部回收的细菌数量表示为平均对数10每个肺的CFU±SEM（误差条）。通过使用单向方差分析（ANOVA）和Bonferroni的多重比较测试（GraphPadPrism）对获得的数据进行统计分析®). 对于面板（A）不同处理之间的显著差异第页检测到<0.001。对于面板（B、C）不同处理之间的显著差异第页检测到<0.05。
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参考文献

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