Improved pyrrolysine biosynthesis through phage assisted non-continuous directed evolution of the complete pathway

doi:10.1038/s41467-021-24183-9

.2021年6月24日；12(1):3914.

doi:10.1038/s41467-021-24183-9。

通过噬菌体辅助的完整途径的非连续定向进化改进吡咯烷生物合成

乔安妮·M·L·何^#¹, 科尔文·A·米勒^#¹, 凯瑟琳·史密斯¹, 雅各布·R·马蒂亚¹, 马修·本内特^2 三

附属公司

¹美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物科学系。
²美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物科学系。matthew.bennett@rice.edu。
^三美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物工程系。matthew.bennett@rice.edu。

^#贡献均等。

PMID： 34168131
PMCID公司： PMC8225853号
内政部： 10.1038/s41467-021-24183-9

通过噬菌体辅助的完整途径的非连续定向进化改进吡咯烷生物合成

乔安妮·M·L·何等。国家公社. 2021.

.2021年6月24日；12(1):3914.

doi:10.1038/s41467-021-24183-9。

作者

乔安妮·M·L·何^#¹, 科尔文·A·米勒^#¹, 凯瑟琳·史密斯¹, 雅各布·R·马蒂亚¹, 马修·本内特^2 三

附属公司

¹美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物科学系。
²美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物科学系。matthew.bennett@rice.edu。
^三美国德克萨斯州休斯顿莱斯大学生物工程系。matthew.bennett@rice.edu。

^#贡献均等。

PMID： 34168131
PMCID公司： PMC8225853号
内政部： 10.1038/s41467-021-24183-9

摘要

吡咯烷（Pyl，O）作为22^第蛋白质生成氨基酸。尽管Pyl是蛋白质的基本组成部分，但其化学和生物合成的困难和低效阻碍了对其的研究。在这里，我们通过合理的工程和对整个生物合成途径的定向进化来改进Pyl的生物合成。为了适应大肠杆菌中Pyl生物合成基因的毒性，我们还开发了交替噬菌体辅助非连续进化（Alt-PANCE），交替诱变和选择性噬菌体生长。与合理工程化的祖先相比，进化的途径提供了32倍的含有Pyl的报告蛋白的产量提高。进化出的PylB突变体在细胞内的水平提高了4.5倍，蛋白酶抗性提高了2.2倍。这项研究表明，Alt-PANCE为进化出具有毒性副作用的蛋白质提供了一种通用方法，并进一步提供了一种能够在大肠杆菌中产生大量Pyl蛋白质的改进途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。通过Alt-PANCE进行Pyl生物合成途径进化。**
A类Pyl生物合成涉及两个赖氨酸分子通过三种酶（自由基SAM酶PylB、依赖ATP的PylC和PylD）缩合。B类生物合成的*pylBCD公司*操纵子被克隆到选择噬菌体（SP）中，而组成性表达*pylST公司*和噬菌体休克启动子控制*gIII型*克隆到辅助质粒（AP）载体中。编号部分表示在进化过程中被改变以控制选择严格性的选择回路元件，包括（1）补充BocK，（2）PylRS的表达水平，（3）使用的PylRS突变变种，以及（4）*gIII型*.C类每轮Alt-PANCE都需要两次噬菌体传代：选择性传代（左）需要PIII（带圆形尖端的粉色杆）的操纵子活性依赖性表达；突变传代（右）需要SP的突变质粒（MP）依赖性突变。

**图2。共同进化中的聚合突变*pylBCD公司*基因。**
A类在之前解决的结构中显示的三个亚群中确定的关键突变位置*巴克尔先生* B类PylB（PDB:3T7V），C类PylC（PDB:4FFP），以及D类PylD（PDB:4J4B）；氨基酸替换都是在酶活性位点之外发现的，许多PylB突变导致阳离子表面电荷增加。编号方案基于野生型蛋白质序列PylB、PylC和PylD乙酸甲烷八叠球菌具体来说，PylB的数字标签是指WT-PylB蛋白质序列，不包括SUMO标签添加的104个氨基酸。括号表示天然残留物*巴克尔先生*从*acetivorans支原体*顺序。观察到以红色突出显示的突变在多个亚群中收敛（有关亚群的进一步突变分析，请参阅补充表2和3）。

**图3。进化的生物合成途径介导提高Pyl蛋白产量。**
A类最佳进化变体（36A_subpop2）和最佳组合变体（3f2）共包含4个和7个突变，其中2个和4个分别为收敛突变（红色）（关于亚群的进一步突变分析，见补充表2和3）。B类在中测试时*大肠杆菌*菌株C321.∆A.exp，sfGFP中三个琥珀色密码子的通读在变体3f2组合变体中提高了32倍，在变体36A_subpop2中提高了6.5倍，相对于亲本变体SUMO-*pylBCD公司*.工作小组*pylBCD公司*通路（称为“未标记的亲本”）没有可检测的活性。C类与变体36A_sub-pop2相比，变体3f2中sfGFP中一个琥珀色密码子的读取量提高了2.4倍。WT公司*pylBCD公司*变体和SUMO-*pylBCD公司*在本试验中没有检测到活性。在面板中B类和C类，显示的荧光强度（激发488nm，发射509nm）由光密度归一化(A类₆₀₀)（见“方法”）。样品进行生物检测，一式三份；所示数据代表平均值±标准差。

**图4。进化出的PylB突变体在细胞内水平升高，表现出更强的蛋白酶抗性。**
A类对表达不同His-tagged PylB变体的细胞的澄清裂解液进行定量western blot分析。在细胞裂解之前，所有培养物都显示出相似的OD₆₀₀值（3.1–3.3），冒号单位（1–3×10⁹CFU/mL）和细胞颗粒湿重（1.2–1.4 g）。对于每个样本，使用His-tag抗体量化PylB，并使用看家基因GAPDH对样本进行标准化（见“方法”）。这些实验显示了两个进化的突变体，PylB.3f2和PylB。与祖先变异体SUMO-PylB相比，JM10.1的浓度更高。这些结果进一步表明，两个密码优化的进化突变体PylB.3f2_道义和PylB。JM10.1标准_道义与密码子优化的祖先变异体SUMO-PylB相比，它们的浓度也更高，这表明进化突变蛋白水平的提高可能不是密码子使用率提高的结果。B类使用纯化的PylB变体进行蛋白质降解分析。蛋白质样品与蛋白酶-糜蛋白酶孵育，并随时间评估PylB的浓度（见“方法”）。进化突变体PylB.3f2和PylB。与祖先变异体SUMO-PylB相比，JM10.1的降解速度较慢，表明进化突变体中的蛋白酶抗性增加。样品在生物六倍体中进行测试；所示数据表示两个图的平均值±标准差A类和B类,第页使用单尾学生的t吨-测试，无需对多次比较进行调整。源数据作为源数据文件提供。

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