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.2021年11月；28(11):3077-3091.
doi:10.1038/s41418-021-00803-1。 Epub 2021年5月20日。

TRIM26通过TAB1的K11连接泛素化正向调节炎症免疫反应

赵健（Jian Zhao） # 1, 蔡保山 # 1, 朱桂韶 1, 张磊（Lei Zhang） 1, 一正 1, 马春红 1, 范毅 2, 刘冰雨 三, 澄江高 4
附属公司

TRIM26通过K11-连接的TAB1泛素化积极调节炎症免疫反应

赵健（Jian Zhao）等。 细胞死亡差异. 2021年11月.

摘要

蛋白质泛素化在TGF-β-活化激酶1（TAK1）介导的NF-κB活化的调节中起着重要作用。众所周知，TAK1的活化与其结合伙伴TAK1结合蛋白（TAB1-3）紧密调控。然而，对TAK1激活的严格监管仍然难以捉摸。在这里，使用Trim26基因敲除小鼠和Trim26转基因小鼠，我们发现Trim26通过泛素化其结合伙伴TAB1发挥TAK1激活的正向调节器的作用。Trim26基因敲除抑制TAK1激活和下游激酶激活，从而减少LPS、TNF-α和IL-1β刺激后促炎细胞因子的诱导。从机制上讲，TRIM26催化TAB1在Lys294、Lys319和Lys335的K11连接的多泛素化，以增强TAK1的激活以及随后的NF-κB和MAPK信号。因此，Trim26缺乏可保护小鼠免受LPS诱导的体内感染性休克。此外，Trim26缺乏可减轻右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎的严重程度。因此，这些发现为TAK1活化如何通过TRIM26介导的TAB1泛素化进行调节提供了新的见解，并揭示了TRIM26在调节炎症天然免疫反应中的新功能。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。TRIM26积极调节TLRs诱导的促炎细胞因子的产生。
A类qPCR分析Tnfα,伊尔6，以及伊利12b制备的PMs中的mRNA表达修剪26+/+和修剪26–/–用LPS（200 ng/ml）刺激小鼠达到指定时间。B类酶联免疫吸附试验（ELISA）检测制备的PMs上清液中的TNF-α、IL-6和IL-12p40蛋白修剪26+/+和修剪26–/–LPS刺激小鼠12小时。C类qPCR分析Tnfα,伊尔6，以及伊利12b分别来自第26页+/+和修剪26–/–小鼠，用Pam3CSK4（1μg/ml）、Poly（I:C）（20μg/ml。D类酶联免疫吸附试验（ELISA）分析制备的PMs中TNF-α、IL-6和IL-12P40蛋白修剪26+/+和修剪26–/–小鼠，用Pam3CSK4（1μg/ml）、Poly（I:C）（20μg/ml。E类qPCR分析Tnfα,伊尔6，以及伊利12b制备BMDM的mRNA表达修剪26+/+和修剪26–/–小鼠，用LPS（200 ng/ml）刺激指定时间。F类qPCR分析Tnfα,伊尔6，以及伊利12bBMDM中mRNA的制备第26页+/+和修剪26–/–小鼠，用Poly（I:C）（20μg/ml）和R848（10μg/ml）刺激6小时。克qPCR分析Tnfα和伊尔6MEF中mRNA的表达修剪26+/+和修剪26–/–胚胎（第13.5天），用LPS（200 ng/ml）刺激指定时间。H（H）qPCR分析Tnfα和伊尔6mRNA分别来自修剪26+/+和修剪26–/–胚胎（第13.5天），用Pam3CSK4（1μg/ml）、Poly（I:C）（20μg/mlA类–H（H）. *第页 < 0.05, **第页 < 0.01; 学生的吨测试。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图2
图2。TRIM26增强TLRs诱导的NF-κB和MAPK信号传导。
A类腹腔巨噬细胞磷酸化IKKα/β、p65、ERK、JNK和p38的免疫印迹分析修剪26+/+和修剪26–/–用LPS刺激小鼠一定时间。B类–D类腹腔巨噬细胞磷酸化IKKα/β、p65、ERK、JNK和p38的免疫印迹分析修剪26+/+和修剪26–/–用Pam3CSK4（1µg/ml）、Poly（I:C）（20µg/ml）或TNF-α（20 ng/ml）刺激小鼠指定时间。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图3
图3。TRIM26介导TAB1的多泛素化并与TAB1相互作用。
A类与Myc-TAB1、Myc-TAK1或Myc-IRF3、Flag-TRIM26和HA-Ub质粒瞬时共转染的HEK293T细胞裂解液用抗Myc Ab进行免疫沉淀，免疫印迹分析后用抗-HA Ab进行。B类来自用Flag-TAB2、Myc-TRIM26和HA-Ub质粒瞬时共转染的HEK293T细胞的裂解物用抗Flag-Ab进行免疫沉淀，随后用抗HA-Ab进行免疫印迹分析。C类使用Myc-TRIM26、Flag-TAB1、GFP-TRIM31或Myc-TAB1联合转染到HEK293T细胞，对TRIM26或TRIM31与TAB1的相互作用进行免疫沉淀分析。D类在体外转录和翻译系统中制备重组TRIM26和TAB1蛋白，使用抗TAB1抗体进行免疫沉淀分析，然后使用抗TRIM26进行免疫印迹分析。E类用LPS（200 ng/ml）刺激腹腔巨噬细胞指定时间的裂解液，用抗TAB1抗体进行免疫沉淀分析，然后分别用抗TRIM26和抗TAB1 Ab进行免疫印迹分析。F类用表达GFP-TRIM26和Myc-TAB1的质粒转染Hela细胞24小时，然后用Myc特异性一级抗体和Alexa-Fluro-568结合的山羊抗兔IgG二级抗体（红色）标记TAB1。比例尺，20μm。克用LPS（200 ng/ml）刺激的共焦显微镜检查MEF中TAB1和Trim26之间的定殖作用。比例尺，20μm。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图4
图4。TRIM26针对TAB1的Lys294、319和335进行K11-连接的多泛素化。
A类用编码Myc-TAB1、HA-ubiquitin（WT）的质粒以及一个或多个编码Flag-TRIM26（WT，或Flag-TRIM26（C16A）或Flag-RIM26（ΔR）的质粒转染HEK293T细胞，对TAB1泛素化进行免疫沉淀分析。B类在体外转录和翻译系统中制备重组TRIM26和TAB1蛋白。在存在Ub、E1、UbcH5c、TRIM26和TAB1的情况下进行体外泛素化分析。用抗TAB1抗体的免疫印迹分析检测TAB1的泛素化。C类将Flag-TRIM26和Myc-TAB1质粒与HA-Ub或其突变体一起转染HEK293T细胞24h，然后与抗Myc Ab共免疫沉淀和抗HA Ab免疫印迹分析。D类用编码Myc-TAB1、HA-ubiquitin（K11）突变体或HA-ubi quitin，K11R突变体的质粒以及编码Flag-TRIM26（WT）或Flag-TRIM26（C16A）或Flage-TRIM27（ΔR）的质粒转染HEK293T细胞，对TAB1泛素化进行共免疫沉淀分析。E类用编码Myc-TAB1、HA-ubiquitin（K11）突变体或与一个或多个编码Flag-TRIM26的质粒一起转染的HEK293T细胞中TAB1泛素化的共免疫沉淀分析。F类在K11-Ub、E1、UbcH5c、TRIM26和TAB1存在下进行体外泛素化测定。用抗TAB1抗体的免疫印迹分析检测TAB1的泛素化。克裂解液来自修剪26+/+和修剪26–/–用LPS（200 ng/ml）刺激小鼠腹腔巨噬细胞达指定时间后，用抗TAB1抗体进行免疫沉淀，然后用抗泛素抗体进行免疫印迹分析。H（H）用编码Myc-TAB1 WT或其突变体的质粒转染HEK293T细胞，再加上Flag-TRIM26和HA-ubiquitin，对TAB1WT及其突变体的多泛素化进行共免疫沉淀分析，其中294、319、335位的赖氨酸残基分别被丙氨酸取代。我用编码Myc-TAB1 WT或其突变体的质粒以及Flag-TRIM26和HA-ubiquitin转染HEK293T细胞，共免疫沉淀分析TAB1-WT及其突变体3KA的多泛素化，其中294、319、335位的三个赖氨酸残基全部被丙氨酸取代。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图5
图5。TRIM26增强TAK1的磷酸化和复合组装。
A类–C类这个修剪26+/+和修剪26–/–用LPS（200 ng/ml）、Poly（I:C）（20μg/ml）或Pam3CSK4（1μg/ml。D类磷酸化（p）和总TAK1、IKKα/β、p65、ERK、JNK和p38的免疫印迹分析修剪26+/+和第26页–/–腹腔巨噬细胞。修剪26–/–在指定时间内用LPS（200 ng/ml）刺激mTrim26或mTrim26A（C16A）载体重建的腹腔巨噬细胞。E类qPCR分析Tnfα,伊尔6，以及伊利12bmRNA表达修剪26+/+和修剪26–/–腹腔巨噬细胞。修剪26–/–用LPS（200 ng/ml）刺激小鼠mTrim26或mTrim26A（C16A）载体重建腹腔巨噬细胞6 hE类. *第页 < 0.05, **第页 < 0.01（单因素方差分析，ANOVA）。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图6
图6。TRIM26缺乏保护小鼠免受LPS诱导的感染性休克。
A类性别和年龄匹配修剪26+/+和修剪26–/–老鼠(n个 = 6） 腹腔注射LPS（40μg/g）4 h。ELISA分析患者血清中TNF-α、IL-6和IL-12p40修剪26+/+和修剪26–/–老鼠。B类 修剪26+/+和修剪26–/–室友(n个 = 12） 用LPS（40μg/g）刺激A类。在接下来的5天内监测小鼠的存活率。C类 修剪26+/+和修剪26–/–小鼠腹腔注射LPS（40μg/g）4h，对小鼠肺损伤进行h&E实验。D类中描述的结肠组织的组织学分析C类.比例尺，100μm。数据显示为中的平均值±标准差A类;n个 = 6只生物独立的动物*第页 < 0.05, **第页 < 0.01;A类学生的吨测试；B类对数槽吨-预计。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。
图7
图7。TRIM26缺乏可减轻右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎。
A类性别和年龄匹配修剪26+/+和修剪26–/–老鼠(n个 = 6） 在饮用水中给予3%的DSS 6天，每天测量体重。B类,C类直肠出血评分和大便稠度修剪26+/+和修剪26–/–每天对小鼠进行评分。D类,E类结肠的宏观外观和结肠长度第26页+/+和修剪26–/–在第6天对小鼠进行测量。F类H&E染色检测结肠组织病理学改变。克中描述的结肠组织的组织学分析（f）.比例尺，500 um。数据显示为平均值±SD inB类,C类,E类;n个 = 6只生物独立的动物*第页 < 0.05, **第页 < 0.01;A类单因素方差分析；B类,C类,E类学生的吨测试。类似结果吨s是在三个独立的实验中获得的。
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