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.2021年1月29日；12(1):682.
doi:10.1038/s41467-021-20979-x。

剪接相关染色质特征：组蛋白标记在剪接定义中的组合和位置依赖性作用

E阿吉尔 1 2, A J奥尔德菲尔德 1, N贝洛拉 三, 塞格尔 1, R F Luco公司 4
附属公司

剪接相关染色质特征：组蛋白标记在剪接定义中的组合和位置依赖性作用

E阿吉雷等。 国家公社. .

摘要

选择性剪接依赖于剪接调控因子对特定RNA结合位点的组合招募。染色质已被证明会影响此次招聘。然而，在全球范围内对有限数量的组蛋白标记进行了研究。在这项工作中，机器学习方法应用于人类H1胚胎干细胞和IMR90胎儿成纤维细胞的广泛表观基因组数据集，确定了11种染色质修饰，这些修饰根据外显子内含物的水平来区别标记选择性剪接外显子。这些标记以组合和位置依赖的方式发挥作用，创造出特征性的分裂相关染色质特征（SACS）。为了支持SACS在协调剪接调控中的功能作用，10个不同细胞系之间SACS标记外显子的选择性剪接的变化与SACS富集水平的变化以及RNA模体搜索分析预测的剪接调控因子的招募相关。我们提出染色质修饰的动态性质是必要时快速微调选择性剪接的机制。

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数字

图1
图1。机器学习方法的原理图管道用于识别染色质修饰，染色质修饰可以将外显子划分为四个不同的剪接类别。
一使用可用的RNA-seq数据集在人类H1胚胎干细胞和IMR90胎儿成纤维细胞中交替剪接外显子的累积分布。根据外显子内含物（PSI）的百分比创建了四个任意组。每个类别都有一个色码，淡蓝色表示完全排除（0<PSI<0.2），深蓝色表示中度排除（0.2<PSI<0.4），橙色表示中度包括（0.4<PSI<0.8），红色表示完全包括（0.8<PSI＜1）。b条利用ENCODE和Roadmap表观基因组学项目提供的ChIP-seq和MeDIP-seq数据，计算了交替剪接外显子3′和5′剪接位点（ss）周围26个组蛋白标记的富集水平和DNA甲基化水平，并将其定义为表观遗传特征。c（c）将随机森林分类器（具有100000棵树和10000次迭代）应用于四个剪接类别之间的所有二进制比较，以确定信息量最大的表观遗传特征，从而将所选剪接事件分类为H1和IMR90细胞中的四个预定义剪接类别。d日将剪接事件分类为H1和IMR90细胞中四个预定义剪接组中任意一个的表观遗传特征按重要性排序。右边显示了两个细胞系之间常见的染色质修饰的最终列表。使用随机剪接水平的相同分析没有选择任何特征。补充数据2中总结了随机森林结果的更多细节。
图2
图2。H1-hESCs中的剪接相关染色质特征（SACS）。
一七种染色质修饰组合（SACS）的示意图，这些染色质修饰可区别标记交替剪接的外显子。作为对照，我们使用了随机剪接水平的外显子和构成外显子，这些外显子总是包含在mRNA中，来自与所分析的选择性剪接外显子相同的基因。对于每个SACS，我们指定与其相关的剪接群、两个共富集组蛋白标记、外显子富集位置（用峰表示）和总数(n个)由染色质签名标记的外显子的数量（括号中，染色质标记外显子所占的百分比与每组分析外显子总数有关）。b条由定义SACS的两个染色质修饰标记的选择性剪接外显子的百分比，仅为两个标记中的一个或没有。
图3
图3。剪接相关染色质特征（SACS）的轮廓。
一H3K4me2的密度分布在3s外显子起点上游以H3K4me1标记的外显子周围。b条H3K9me3读取外显子5’s末端下游以5mC标记的外显子。c（c）H4K91ac读取H4K20me1标记的外显子。d日H3K9ac读取外显子起始上游H3K14ac标记的外显子。e（电子）H3K79me2读取H4K20me1标记的外显子。（f）H3K9me3读取大约5mC标记的外显子。克H3K27me3读取外显子末端下游H3K4me3标记的外显子。小时H3K36me3使用来自H1 hESCs的可用ChIP-seq数据集，在排除（不包括，浅蓝色）、排除中期（不包括，深蓝色）、包含中期（包括，黄色）、包含（包括，红色）和组成型（常量，灰色）外显子中读取约H4K20me1标记的外显子。组蛋白标记读取的平均读取计数和±SEM表示为来自5′或3′剪接位点（ss）的±250 bp，具体取决于SACS。对于每个标记，我们用黑色箭头突出显示在SACS定义的调控外显子周围特定位置富集程度最高的剪接群。请注意，H3K9me3+5mC在包含（SACS2）和排除（SACS5）外显子处均富集，但在不同位置，这就是为什么有两个箭头（灰色表示对应于其他SACS的富集）。
图4
图4。不同细胞系SACS外显子的实验验证。
一–e（电子）SACS4中标记的外显子数量(一)、SACS3(b条)、SACS5(c（c）)、SACS1(d日)或SACS7(e（电子）)在H1中，当拼接到具有适当表观基因组数据的其他细胞系中时，保持或不保持SACS富集（补充数据1中有关细胞系的详细信息）。根据所分析的其他细胞系中的剪接模式，外显子被分为包括（Include）、排除（Exclude）、中间包括（mid-include。）或中间排除（mid-ex）。仅研究H1和任何其他细胞系中共同表达的选择性剪接事件。第页-Fisher精确检验中的值<0.05，双面。（f）–k个在电子版中获得的结果的实验验证。K562（黑色）和HeLa S3（浅绿色）细胞中包含（包括）、排除（不包括）或中间排除（mid-ex）的选择性剪接外显子处的H3K79me2、H4K20me1、H3K4me1、H3G4me2、H3K9ac和H3K14ac富集水平。在（f）,小时,j个外显子包含水平由相应基因的总表达水平进行标准化。低于0.2（用虚线突出显示）的外显子被视为被排除。数据描述为平均值±SEMn个 = 通过定量RT-qPCR进行4个独立实验。在克,我,k个所研究的组蛋白标记在交替剪接的外显子处的富集水平（%输入）被标准化为两个对照区，这两个对照区在细胞类型之间保持不变。数据描述为平均值±SEM，至少n个 = 通过定量ChIP-qPCR进行4个独立实验**第页-值<0.01***第页-值<10−5(T型-测试，双面）。我,米等同于（f）,克但这一次显示了在K562（黑色）和MCF10a（绿色）之间切换外显子内含物水平的三个交替剪接事件（AS）。两个包含的和两个排除的事件在单元格类型之间不发生变化，显示为控件*第页-值<0.05**第页-值<0.01和***第页-值<0.001(T型-测试，双面）。
图5
图5。染色质标记的交替剪接外显子（SACS）的遗传特征。
一3′和5′剪接位点（ss）强度得分的方框图。b条外显子和上游和下游内含子长度的盒形图（单位：bp）。c（c）到转录起始位点（TSS）的距离的方框图，单位为Kb。d日累积条形图，表示沿基因每个外显子位置的剪接事件数量，以及每个基因外显子数量的方框图。e（电子）交替剪接外显子GC含量百分比的log2比值的框线图与上游或下游侧翼内含子有关。（f）正常化基因表达水平的方框图，表示为对数（TPM）。每个染色质标记剪接组（SACS）都有自己的颜色代码，如图例所示。盒形图以中位数为中心，所有外显子的四分位范围都富集在具有SACS1外显子且具有特定SACS的外显子中n个 = 165，SACS2外显子n个 = 142，SACS3外显子n个 = 143，SACS4外显子n个 = 152，SACS5外显子n个 = 89，SACS7外显子n个 = 139，未标记排除外显子n个 = 600，未标记包含外显子n个 = 600和构成外显子n个 = 600.构成外显子（灰色+黑色）和非标记排除+中间排除（灰色+蓝色）和包含+中间包含（灰色+红色）外显子用作对照*第页-值<0.01和**第页-与构成外显子（黑色）或相应的选择性剪接控制外显子相比，双侧Wilcoxon秩检验中的值<0.001。
图6
图6。SACS是由特定的RNA结合蛋白（RBP）基序定义的。
一–d日上游内含子（左）、染色质标记外显子（中）和下游内含子（右）中扫描的RBP基序和5mers的火山图一包括H3K9me3+5mC标记的外显子（SACS2），b条排除H3K9me3+5mC标记外显子（SACS5），c（c）排除H4K20me1+H3K79me2标记的外显子（SACS4）和d日中间包括H4K20me1+H4K91ac标记的外显子（SACS3）。彩色圆点与经过调整的图案相对应第页-值<0.01，Benjamini和Hochberg假发现率FDR<0.05。X（X）轴表示与非标记交替剪接事件序列相比，每个基序的对数2倍富集（FC）。Y（Y）轴表示调整后的−log10第页-浓缩的价值。FDR和相关调整第页-值是根据n个 = 152 H4K20me1+H3K79me2排除外显子，n个 = 89 H3K9me3+5mC除外，n个 = 143个H4K20me1+H4K91ac中间内含外显子，n个 = 142 H3K9me3+5mC包含外显子，n个 = 600个非染色质标记的排除外显子和n个 = 600个非染色质标记的外显子。
图7
图7。SACS可以影响RNA聚合酶II的分布和剪接因子的招募。
一盒形图以正常化RNA聚合酶II（RNAPII）四分位范围的中位数为中心，读取染色质标记外显子上游内含子、外显子和下游内含子的覆盖范围。构成和未标记的排除和包含外显子用作对照（灰色阴影）。除H3K4me1+H3K4me2（SACS1）和H3K9me3+5mC（SACS2）包含外显子外，RNA聚合酶II在所有条件下的外显子富集程度均高于内含子**第页-在双侧Wilcoxon秩检验中，外显子与侧翼内含子的值<0.01。SACS1外显子n个 = 165，SACS2外显子n个 = 142，SACS3外显子n个 = 143，SACS4外显子n个 = 152，SACS5外显子n个 = 89，SACS7外显子n个 = 139，未标记排除外显子n个 = 600，未标记包含外显子n个 = 600和构成外显子n个 = 600b条每个SACS组的平均核小体占有信号±200 bp，外显子从3s开始。c（c）根据GM19238细胞的可用数据，hnRNPK敲除后选择性剪接外显子的剪接效应。只研究了在H1和GM19238细胞中同时表达的基因。使用K562和HepG2细胞中公开可用的eCLIP数据，还显示了具有hnRNPK结合证据的hnRNPK-依赖性事件的数量。hnRNPK敲除后更多包含的外显子显示为红色，更多排除的外显素显示为蓝色，未受影响的外显蛋白显示为灰色。d日H4K20me1+H3K79me2水平的hnRNPK结合和富集在不同细胞系中交替剪接外显子改变剪接模式。使用K562和HepG2细胞中可用的eCLIP和ChIP-seq数据，我们发现在H1-hESC中52个被排除的富含H4K20me1+H3K79me2的外显子中，33个仍然被排除，19个转换为包含在K562或HepG2中。排除的事件在H4K20me1+H3K79me2中的共同富集程度高于包括的事件（Fisher精确检验，双侧，第页-值<0.05），且大多数富含（H4K20me1+H3K79me2）的排除事件受hnRNPK（Fisher精确检验，双侧，第页-值<0.05），支持一个模型，在该模型中，特定染色质特征有助于剪接调控因子对前mRNA的招募。
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