跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2021年1月至6月：296:100046。
doi:10.1074/jbc。RA120.014479。 Epub 2020年11月24日。

89kDa PARP1切割片段作为细胞质PAR载体诱导AIF介导的细胞凋亡

Masato Mashimo公司 1, 玛尤·奥尼西 2, 阿里娜·乌诺 2, Akari Tanimichi先生 2, Akari Nobeyama公司 2, 玛娜·莫里 2, 山田沙耶香 2, Shigeru Negi公司 三, 香宁卜 4, 加藤次郎 4, 乔尔·莫斯 4, 三田诺里子 三, Ryoichi Kizu公司 三, 藤井武史 2
附属公司

89-kDa PARP1切割片段作为细胞质PAR载体诱导AIF介导的细胞凋亡

Masato Mashimo等。 生物化学杂志. 2021年1月-6月.

摘要

聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）是一种核蛋白，通过与DNA损伤结合而激活，并催化核受体蛋白（包括PARP1本身）的聚（ADP-核糖基）化，以向DNA损伤招募DNA修复机制。当DNA发生过度损伤时，PARP1产生的聚ADP-核糖（PAR）转移到细胞质，改变细胞质蛋白的活性和定位，如凋亡诱导因子（AIF）、己糖激酶，导致细胞死亡。这种级联反应称为parthanatos，是一种与坏死和凋亡不同的非半胱氨酸蛋白酶依赖的程序性细胞死亡。相反，PARP1是caspase依赖性凋亡中激活的caspase 3和7的底物。一旦被切割，PARP1就会失去活性，从而抑制DNA修复。PARP1的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解发生在DNA结合域附近的核定位信号中，导致形成24-kDa和89-kDa片段。在本研究中，我们发现半胱天冬酶通过葡萄孢霉素和放线菌素D激活，诱导PARP1自溶（ADP-核糖基）和裂解，生成聚ADP-核糖基化89-kDa和24-kDaPARP1片段。带有共价连接PAR聚合物的89-kDa PARP1片段移位到细胞质，而24-kDa-片段仍然与DNA损伤相关。在细胞质中，AIF与附在89-kDa PARP1片段上的PAR结合，促进其向细胞核移位。因此，89-kDa PARP1片段是细胞质中的PAR载体，可诱导线粒体释放AIF。对凋亡和部分死亡途径之间caspase介导的相互作用的解释扩展了程序性细胞死亡机制的现有知识，并可能导致新的治疗靶点。

关键词：细胞凋亡；凋亡诱导因子；半胱氨酸天冬氨酸酶；细胞死亡；帕萨纳托斯；聚ADP-核糖聚合酶1；聚（ADP-核糖基）化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1
图1
星形孢霉素暴露后半胱氨酸蛋白酶激活后PARP1介导的AIF释放.A、，staurosporine暴露后PARP依赖性细胞死亡。HeLa细胞在指定浓度下暴露于staurosporine（6 h）。PJ34（10微米）(左边)或ABT888（10μM）(正确的)在staurosporine暴露前加入30分钟（平均值±S.E.M.，n=3）第页 < 0.001与控制在300 nM以上（双向方差分析和事后Tukey测试）。B中，zVAD-fmk对staurosporine诱导的细胞死亡的影响。在staurosporine暴露前，添加zVAD-fmk（50μM）和PJ34（10μM）30分钟（平均值±S.E.M.，n=3）第页 < 0.001与控制在200 nM以上（双向方差分析和事后Tukey测试）。C中，稳定表达PARP1 shRNA的HeLa细胞中PARP1的表达。右图显示了PARP1表达水平。PARP1蛋白水平归一化为GAPDH（平均值±S.E.M.，n=3）第页<0.001与控制（学生的t吨测试）。D、，暴露于staurosporine后PARP1缺失对细胞活力的影响。将细胞暴露于指定浓度的staurosporine（6 h）（平均值±S.E.M.，n=3）第页 < 0.001与控制在200 nM以上（双向方差分析和事后Tukey测试）。E、，接触staurosporine后产生PAR。在300 nM staurosporine暴露前，将zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）添加到培养基中30分钟。GAPDH被用作负荷控制。条形图表示用合并密度测定数据评估的PAR产量（平均值±S.E.M.，n=3）。将数据归一化为0 h时PAR与GAPDH的比值为100%。F、，暴露于300 nM staurosporine 6小时后，HeLa细胞细胞核内AIF积聚。使用抗AIF抗体对细胞进行免疫细胞化学(绿色)，抗Tom20抗体(红色)和DAPI染色(蓝色). 右图显示了细胞核与线粒体AIF荧光的比率（平均值±S.E.M.，n=3）。*第页 < 0.05与对照组（单向方差分析和事后Tukey检验）。比例尺代表20μm。G、，AIF在细胞核中的定位。暴露于staurosporine（300 nM）6小时后，分离出细胞核和细胞质/线粒体部分。在staurosporine暴露前，添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）30分钟。组蛋白H3和GAPDH分别用作核标记和细胞质标记。H、，暴露于300nM星形孢菌素6小时后的细胞核收缩。DAPI用于测量HeLa细胞的细胞核大小。比例尺代表10μm。右图显示了平均细胞核大小（平均值±标准电镜，n=100–300个细胞）。*第页 < 0.05与对照组（单向方差分析和事后Tukey检验）。凋亡诱导因子AIF；DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；PARP1，聚ADP-核糖聚合酶1。
图2
图2
caspase-3对PARP1的切割导致89-kDa PARP1片段移位到细胞质。A、，staurosporine暴露后PARP1和caspase-3（c-caspase-2）的裂解。在300 nM staurosporine暴露前，将zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）添加到培养基中30分钟。抗PARP1抗体识别全长PARP1及其89-kDa PARP1片段。GAPDH被用作负载控制。条形图表示劈开的PARP1(左边)和半胱天冬酶-3(正确的)分别用合并密度测定数据进行评估（平均值±标准误差平均值，n=3）。将数据归一化为裂解蛋白质与总蛋白质的比率。B中，300 nM staurosporine暴露指定时间后PARP1和PAR定位的时间依赖性变化。使用抗PARP1抗体对细胞进行免疫细胞化学(绿色)，抗PAR抗体(红色)和DAPI染色(蓝色). 黄线表示原子核的位置。比例尺代表20μm。C中，caspase和PARP抑制对PARP1定位的影响。在暴露于300 nM staurosporine 6小时之前，添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）30分钟。比例尺代表20μm。D、，暴露于staurosporine（300 nM）6小时后PARP1的亚细胞定位。亚细胞分离用于分离细胞核（N）和细胞质（C）组分。组蛋白H3和GAPDH分别用作核标记和细胞质标记。W表示整个单元格。E、，caspase和PARP抑制对亚细胞PARP1定位的影响。在暴露于staurosporine（300 nM）6小时之前，添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）30分钟。条形图表示核中裂解PARP1与总PARP1的比率(白色)和细胞质(黑色)分数，用合并密度测定数据评估（平均值±S.E.M.，n=3）。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；聚（ADP-核糖）；PARP1，聚（ADP核糖）聚合酶1。
图3
图3
staurosporine暴露后PARP1-GFP和mCherry-PARP1的不同动态。A、，PARP1-GFP和mCherry-PARP1结构的示意图。B中，PARP1-GFP和mCherry-PARP1在HeLa细胞中的表达。转染1天后，使用抗PARP1抗体进行Western blotting以确认表达。下箭头表示HeLa细胞中内源性PARP1表达，而上箭头表示外源性PARP1。C中，暴露于staurosporine（300 nM）6小时后PARP1结构的定位。细胞核用DAPI染色(蓝色).黄色的线条表示原子核的位置。比例尺代表10μm。D类和F类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活对PARP1构建物向微辐射诱导的DNA损伤募集的影响。在暴露于staurosporine（300 nM）2小时之前，添加zVAD-fmk（50μM）30分钟。将用PARP1构建体瞬时转染的细胞在所示的圆圈处进行微辐射。比例尺代表10μm。右图显示了PARP1结构在圆周处的荧光时间进程。每隔2秒拍摄一次图像，持续10分钟。E类和G、，caspase激活对平均振幅的影响(左边)和衰减时间常数(正确的)在不使用或使用staurosporine（300 nM）和zVAD-fmk（50μM）进行微照射后构建的PARP1（平均值±S.E.M.，n=8）。**第页 < 0.01, ∗∗∗第页 < 0.001与对照组（单向方差分析和事后Tukey检验）。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；PARP1，聚ADP-核糖聚合酶1。
图4
图4
89-kDa PARP1片段移位到带有PAR的细胞质。A、，使用GST大域进行GST下拉分析。用PAR自身修饰的重组人PARP1蛋白与重组人caspase-3蛋白孵育4 h。使用GST大结构域GST下拉试验分离聚ADP-核糖基化蛋白。B中，聚（ADP-核糖基）在细胞质中标记89-kDa PARP1片段。HeLa细胞暴露于300 nM staurosporine 4 h(左边)无或有PJ34（10μM）(正确的). 亚细胞分离后，使用GST大结构域对细胞质组分进行GST下拉分析。组蛋白H3和GAPDH分别用作细胞核和细胞质标记。C中，PARP1 D214G-GFP结构示意图。D、，HeLa细胞中PARP1-GFP WT和D214G的表达。转染1天后，使用抗PARP1抗体进行Western blotting以确认表达。下箭头表示HeLa细胞中内源性PARP1表达，而上箭头表示外源性PARP1。E、，暴露于staurosporine（300 nM）6小时后PARP1 D214G-GFP和PAR的定位。细胞核用DAPI染色(蓝色). 黄线表示原子核的位置。比例尺代表10μm。F、，半胱天冬酶激活对PARP1 D214G募集至微辐射所致DNA损伤的影响，微辐射暴露于staurosporine（300nM）2h。用PARP1 D214G-GFP瞬时转染的细胞在指定的圆圈处接受不含或含300 nM staurosporine的微照射。比例尺代表10μm。右图显示了PARP1 D214G在圆周处的荧光时间进程。每隔2秒拍摄一次图像，持续10分钟。G、，胱天蛋白酶激活对平均振幅的影响(左边)和衰减时间常数(正确的)不使用或使用300 nM staurosporine进行微照射后，PARP1 D214G-GFP的含量（平均值±S.E.M.，n=8）与控制（学生的t吨测试）。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；聚（ADP-核糖）；PARP1，聚ADP-核糖聚合酶1；WT，野生型。
图5
图5
89-kDa PARP1片段通过PAR聚合物结合AIF。A、，89-kDa PARP1片段结合AIF。在暴露于staurosporine 4h后，用抗AIF抗体进行免疫沉淀，然后用抗PARP1抗体进行Western印迹。GAPDH用于装载控制。B中，89-kDa PARP1片段通过细胞质中的PAR聚合物结合AIF。在暴露于staurosporine（300 nM）4小时之前，添加PJ34（10μM）30分钟。亚细胞分离后，用抗AIF抗体和抗PARP1抗体免疫沉淀细胞质/线粒体部分，然后用抗PARPI抗体免疫印迹(左边)和抗AIF抗体(正确的)分别是。GAPDH和Tom20分别用作细胞质和线粒体标记。AIF，凋亡诱导因子；免疫沉淀；PARP1，聚ADP-核糖聚合酶1。
图6
图6
放线菌素D暴露后半胱氨酸蛋白酶激活后PARP1介导的AIF释放。A、，放线菌素D诱导细胞死亡。HeLa细胞在指定浓度下暴露于放线菌素D（12 h）。在放线菌素D暴露前30分钟添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）（平均值±S.E.M.，n=3）第页 < 0.001与控制在200 nM以上（双向方差分析和事后Tukey测试）。B中，PARP1缺失对放线菌素D诱导的细胞死亡的影响（平均值±S.E.M.，n=3）。在评估细胞活力之前，将稳定表达对照或PARP1 shRNA的HeLa细胞暴露于放线菌素D中24小时第页 < 0.001与控制在100 nM以上（双向方差分析和事后Tukey测试）。C中，放线菌素D暴露后PAR合成的时间进程。在暴露于放线菌素D（300 nM）指定时间后，使用抗PAR抗体对稳定表达对照和PARP1 shRNAs的HeLa细胞进行Western blotting。GAPDH用于负载控制。D、，放线菌素D暴露后PAR定位的时间进程。在暴露于放线菌素D（300 nM）指定时间后，使用抗PAR抗体对细胞进行免疫细胞化学(红色). DAPI被用作核标记物。E、，caspase和PARP抑制对PAR定位的影响。在放线菌素D（300 nM）暴露前添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）。使用抗PAR抗体对HeLa细胞进行免疫细胞化学(绿色). DAPI被用作核标记物。比例尺代表30μm。F、，放线菌素D暴露6h后HeLa细胞细胞核内AIF的积累。用抗AIF抗体对细胞进行免疫细胞化学(绿色)，抗Tom20抗体(红色)和DAPI染色(蓝色). 比例尺代表20μm。右图显示了细胞核与线粒体AIF荧光的比率。（指±S.E.M.，n=3）。*第页 < 0.05与对照组（单向方差分析和事后Tukey检验）。G、，AIF在细胞核中的定位。暴露于放线菌素D（300 nM）6小时后，分离出细胞核和细胞质/线粒体部分。在staurosporine暴露前，添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）30分钟。组蛋白H3和GAPDH分别用作核标记和细胞质标记。H、，放线菌素D暴露6h后细胞核收缩。放线菌素D（300nM）暴露后，用DAPI测量HeLa细胞的细胞核大小。比例尺表示20μm。右图显示了平均细胞核大小（平均值±标准电镜，n=100–300个细胞）。*第页 < 0.05与对照组（单向方差分析和事后Tukey检验）。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；PAR，聚（ADP-核糖）。
图7
图7
放线菌素D诱导的PARP1裂解导致89-kDa PARP1片段移位到细胞质，并通过PAR聚合物与AIF结合。A、，放线菌素D暴露后PARP1和caspase-3断裂。在放线菌素D（300 nM）暴露指定时间后，用抗PARP1抗体和抗痉挛-3抗体对细胞进行Western印迹。抗PARP1抗体识别全长PARP1和89-kDa PARP1片段。GAPDH被用作负荷控制。条形图表示劈开的PARP1(左边)和capase-3(正确的)分别用合并的密度测量数据进行评估（平均值±S.E.M.，n=3）。将数据归一化为裂解蛋白质与总蛋白质的比率。B中，暴露于放线菌素D（300 nM）6小时后PARP1和PAR的细胞内定位。使用抗PARP1抗体对细胞进行免疫细胞化学(绿色)，抗PAR抗体(红色)和DAPI染色(蓝色).黄色的线条表示原子核的位置。比例尺代表20μm。C中，暴露于放线菌素D 6 h后PARP1结构的定位。HeLa细胞暴露于放射线菌素D（300 nM）6 h。细胞核用DAPI染色(蓝色). 黄线表示原子核的位置。比例尺代表10μm。D、，暴露于放线菌素D（300 nM）6小时后PARP1的亚细胞定位。亚细胞分离用于分离细胞核（N）和细胞质（C）组分。组蛋白H3和GAPDH分别用作核标记和细胞质标记。W表示整个单元格。E、，caspase和PARP抑制对亚细胞PARP1定位的影响。在暴露于放线菌素D（300 nM）6小时之前，添加zVAD-fmk（50μM）或PJ34（10μM）30分钟。条形图表示核中裂解PARP1与总PARP1的比率(白色)和细胞质(黑色)分数，用合并密度测定数据评估（平均值±S.E.M.，n=3）。F、，细胞质中PAR自身修饰的89-kDa PARP1片段的鉴定。HeLa细胞暴露于放线菌素D（300 nM）4 h(左边)无或有PJ34（10μM）(正确的). 亚细胞分离后，使用GST大结构域对细胞质组分进行GST下拉分析。组蛋白H3和GAPDH分别用作细胞核和细胞质标记。G、，89-kDa PARP1片段结合AIF。在放线菌素D（300 nM）暴露4小时后，用抗AIF抗体对细胞进行免疫沉淀，然后用抗PARP1抗体进行免疫印迹。GAPDH用于装载控制。H、，89-kDa PARP1片段通过细胞质中的PAR聚合物结合AIF。在暴露于300nM星形孢菌素4小时之前，加入PJ34（10μM）30分钟。亚细胞分离后，用抗AIF抗体免疫沉淀细胞质/线粒体部分，然后用抗PARP1抗体免疫印迹。GAPDH和Tom20分别用作细胞质和线粒体标记。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；PARP1，聚ADP-核糖聚合酶1；PJ34，PARP抑制剂；zVAD，半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
图8
图8
89-kDa PARP1片段作为PAR载体，在半胱氨酸蛋白酶激活后促进AIF介导的细胞死亡。（1） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活导致聚积在DNA损伤处的聚ADP-核糖基化PARP1裂解为24-kDa和89-kDaPARP1片段。（2） 带有PAR聚合物的89-kDa PARP1片段从细胞核转移到细胞质，而24-kDaPARP1持续与DNA损伤相关。（3） 连接到89-kDa PARP1片段的PAR聚合物与AIF结合，导致AIF从线粒体膜释放。（4） AIF被转位到细胞核，在那里它通过DNA酶诱导大规模DNA片段化，导致细胞死亡。AIF，凋亡诱导因子。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Ame J.C.、Spenlehauer C.、de Murcia G.PARP超家族。生物论文。2004;26:882–893。-公共医学
    1. Gupte R.，Liu Z.，Kraus W.L.PARP和ADP-核糖基化：分子功能与生物结果关联的最新进展。基因开发2017；31:101–126.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. D’Mours D.、Desnoyers S.、D’Silva I.、Poirier G.G.聚（ADP-核糖基）化反应在核功能调节中的作用。生物化学。J.1999；342（第2部分）：249–268。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gibson B.A.，Kraus W.L.对聚（ADP-核糖）和PARP的分子和细胞功能的新见解。自然修订版分子细胞生物学。2012;13:411–424.-公共医学
    1. Verheugd P.，Butepage M.，Eckei L.，Luscher B.ADP核糖基化的参与者：阅读器和橡皮擦。货币。蛋白质肽。科学。2016;17:654–667.-公共医学

出版物类型

MeSH术语