Molecular basis of CTCF binding polarity in genome folding

doi:10.1038/s41467-020-19283-x

.2020年11月5日；11(1):5612.

doi:10.1038/s41467-020-19283-x。

基因组折叠中CTCF结合极性的分子基础

附属公司

¹格莱斯顿学院，加利福尼亚州旧金山，94158，美国。elphege.nora@ucsf.edu。
²罗德恩贝里干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿，94158。elphege.nora@ucsf.edu。
^三加利福尼亚大学旧金山分校心血管研究所，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。elphege.nora@ucsf.edu。
⁴加利福尼亚大学旧金山分校生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。elphege.nora@ucsf.edu。
⁵巴黎索邦大学PSL研究大学居里研究所物理奇米·居里实验室，CNRS UMR168，26 Rue D'Ulm，Paris，75005，France。
⁶格莱斯顿学院，加利福尼亚州旧金山，94158，美国。
⁷美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿的罗登伯里干细胞生物学和医学中心，94158。
⁸华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国。
⁹美国加州大学伯克利分校。
¹⁰PSL研究大学居里研究所，CNRS UMR 3215，INSERM U934，哺乳动物发育表观遗传学小组，F-75005，法国巴黎。
¹¹法国巴黎索邦大学F-75005。
¹²法国巴黎索邦大学PSL研究大学居里研究所，CNRS UMR3664，核动力单元，F-75005。
¹³美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院医学工程与科学研究所和物理系，邮编02139。
¹⁴美国加利福尼亚大学旧金山分校流行病学与生物统计学系、人类遗传学研究所、定量生物学研究所和计算健康科学研究所。
¹⁵Chan Zuckerberg Biohub，美国加利福尼亚州旧金山。
¹⁶格莱斯顿学院，加利福尼亚州旧金山，94158，美国。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。
¹⁷罗德恩贝里干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿，94158。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。
¹⁸加利福尼亚大学旧金山分校心血管研究所，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。
¹⁹加利福尼亚大学旧金山分校儿科，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。

PMID： 33154377
PMCID公司： PMC7645679号
内政部： 10.1038/s41467-020-19283-x号

基因组折叠中CTCF结合极性的分子基础

埃尔菲奇·诺拉等。国家公社. 2020.

.2020年11月5日；11(1):5612.

doi:10.1038/s41467-020-19283-x。

附属公司

¹格莱斯顿学院，加利福尼亚州旧金山，94158，美国。elphege.nora@ucsf.edu。
²罗德恩贝里干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿，94158。elphege.nora@ucsf.edu。
^三加利福尼亚大学旧金山分校心血管研究所，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。elphege.nora@ucsf.edu。
⁴加利福尼亚大学旧金山分校生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。elphege.nora@ucsf.edu。
⁵巴黎索邦大学PSL研究大学居里研究所物理奇米·居里实验室，CNRS UMR168，26 Rue D'Ulm，Paris，75005，France。
⁶格莱斯顿学院，加利福尼亚州旧金山，94158，美国。
⁷罗德恩贝里干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿，94158。
⁸华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国。
⁹美国加州大学伯克利分校。
¹⁰PSL研究大学居里研究所，CNRS UMR 3215，INSERM U934，哺乳动物发育表观遗传学小组，F-75005，法国巴黎。
¹¹法国巴黎索邦大学F-75005。
¹²法国巴黎索邦大学PSL研究大学居里研究所，CNRS UMR3664，核动力单元，F-75005。
¹³美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院医学工程与科学研究所和物理系，邮编02139。
¹⁴美国加利福尼亚大学旧金山分校流行病学与生物统计学系、人类遗传学研究所、定量生物学研究所和计算健康科学研究所。
¹⁵Chan Zuckerberg Biohub，美国加利福尼亚州旧金山。
¹⁶格莱斯顿学院，加利福尼亚州旧金山，94158，美国。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。
¹⁷罗德恩贝里干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿，94158。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。
¹⁸加利福尼亚大学旧金山分校心血管研究所，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。benoit.bruneau@glastone.ucsf.edu。
¹⁹加利福尼亚大学旧金山分校儿科，加利福尼亚州旧金山，94143，美国。benoit.bruneau@gladstone.ucsf.edu。

PMID： 33154377
PMCID公司： PMC7645679号
内政部： 10.1038/s41467-020-19283-x号

摘要

目前的模型认为，哺乳动物拓扑关联结构域（TAD）的边界源自CTCF蛋白阻止粘连蛋白挤压染色质环的能力。虽然CTCF基序的方向决定了哪对CTCF位点优先稳定环，但这种极性的分子基础尚不清楚。通过结合ChIP-seq和单分子实时成像，我们报告CTCF定位粘附素，但不能控制其在染色质上的整体结合动力学。使用诱导互补系统，我们发现缺乏N末端的CTCF突变体不能正确隔离TAD。凝集素仍保留在该突变株的CTCF位点，尽管富集度降低。鉴于CTCF基序的方向在从TAD内部转位时呈现N末端朝向内聚素，这些观察解释了CTCF结合位点的方向如何转化为基因组折叠模式。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。CTCF是一种定位因子，但不是内聚素的荷载因子。**
一,b条CTCF–AID mESC中的CTCF耗尽后，CTCF峰值处的RAD21 ChIP-seq富集丢失。**c（c）**ChIP-seq读取映射到鼠标与峰值输入的百分比(*果蝇属*)基因组，在CTCF–AID mESCs中使用针对小鼠CTCF或小鼠RAD21的抗体，将其标准化为生长素消耗CTCF之前获得的值。每个复制都单独绘制。d日活体CTCF中单个内源性凝集素分子的HILO成像–AID RAD21–HaloTag敲除mESCs标记有限制性JF549配体（50毫秒采集）。**e（电子）**由*xy公司*单细胞行扫描，显示RAD21–Halotag在mESC中的各种扩散行为（50毫秒采集）。**（f）**扩散系数的分布(D类_安装)RAD21分子的表达，尽管在统计学上有显著差异，但仅因CTCF缺失而略有改变。在循环mESCs和克非循环星形胶质细胞。总的来说，50毫秒的收购。比较未经处理和经生长素处理的细胞中logD累积分布的双面KS检验：第页 = 对于mESC和第页 = 星形胶质细胞0.0014，汇集所有细胞的轨迹。小时RAD21轨迹（50毫秒采集）的异常扩散指数表明，所成像的RAD21分子绝大多数是次扩散的（<1）。我CTCF耗竭不会改变结合凝集素的比例（5毫秒采集）。由SORORIN耗尽触发的有丝分裂阻滞是自由扩散凝聚素的阳性控制，因为大多数凝聚素在前期被卸载。具有标准偏差的平均值。有关详细统计信息，请参见“方法”。源数据作为源数据文件提供。

**图2。缺失扫描显示CTCF的氨基末端结构域介导TAD折叠。**
一使用稳定转基因mESCs进行CTCF突变分析的实验管道。红星表示氨基酸取代，详见“方法”。流式细胞术证实转基因的均匀诱导（仅显示全长）。门是使用未标记的单元放置的。b条用dox和生长素处理的16个稳定mESC系的44个5C实验总结。每个数据点是最初在WT处理的样品中检测到的六个TAD边界处的绝缘得分的平均值，在至少两个5C重复中取平均值，并表示为相对于全长CTCF转基因中测得的绝缘的比率。转基因表达值对应于至少两个重复的流式细胞术平均值。虚线显示了绝缘对转基因表达的依赖性的线性回归，并且是通过比较具有高、低或无全长CTCF的全长转基因表达的细胞系而获得的。所有锌指（ZFs）突变的转基因表达较差，未通过5C进行评估。**c（c）**,d日5C数据的快照在15 kb处装箱，相应的差热图突出了Δ（1–265）突变体中的折叠缺陷。单位是标准化计数——见“方法”。

**图3。CTCF N末端参与CTCF位点的黏着蛋白定位，但并非严格要求。**
一ChIP-seq轨道快照，b条,**c（c）**密度图，d日,**e（电子）**散点图，以及**（f）**峰值读取分数（FRIP）得分表明，在表达CTCFΔN（1–265）的细胞中，RAD21仍在CTCF峰值处检测到，尽管与全长CTCF转基因相比，其富集度降低了两倍。CTCF ChIP-seq数据来自参考文献。

**图4。CTCF N末端可以通过与WAPL和SORORIN共享的基序与PDS5A凝集素亚基相互作用。**
一荧光三杂交装置测试CTCF在BHK-LacO细胞中招募凝集素亚单位的能力。b条,**c（c）**PDS5A是F3H通过CTCF招募的唯一亚单位。每个数据点对应于GFP-阳性LacO阵列中绿色（CTCF）和红色（凝集素亚基）通道之间的Pearson相关性。高值表示CTCF和凝集素亚基在阵列上的高度共定位。箱线图显示了第一个和第三个四分位和中间值。d日删除CTCF N（13–33）可防止F3H招募PDS5A。**e（电子）**,**（f）**N（13–33）-eGFP足以在F3H招募PDS5A。克CTCF N（23–27）与已知的WAPL、SORORIN和HASPIN的PDS5结合区对齐，据报道与PDS5的APEAP基序相互作用。小时PDS5A的APEAP基序突变可防止其在F3H分析中被CTCF招募。CTCF N（23–27）的丙氨酸替代可防止CTCF招募PDS5A。

**图5。CTCF N端突变的5C和Hi-C分析。**
一如图2b所示，在含有CTCF转基因的稳定mESC系中进行的5C实验总结，CTCF基因具有N末端突变，并用dox和生长素处理。图2b中再现了彩色数据点，以进行比较。b条利用内源性CTCF等位基因N区（13-33）细胞的5C数据进行TAD绝缘分析。每个点是在一次5C复制中测量的平均绝缘，缺口标记为中值。**c（c）**表达CTCF转基因的稳定mESC系中的Hi-C。在所选基因型的总热量图旁边，描述了总保温分数。每个点都是在一次Hi-C复制中测量的平均绝缘值，缺口标记为平均值。d日数据与中的相同b条用于骨料峰值分析。

**图6。CTCF N末端在染色体折叠中作用的总结模型。**
当遇到绑定的CTCF位点时，粘连蛋白停止，与基序方向无关^,由于CTCF DNA基序的非顺式性质，CTCF N末端对凝集素保留和DNA环稳定的影响极化到CTCF结合位点的一侧。总之，这些事件导致成对相互作用的TAD边界优先由收敛方向的CTCF基序填充。删除CTCF的N末端后，凝集素占用率降低但仍可检测到，这表明凝集素在遇到结合的CTCF位点时仍会暂停。凝集素占用率的下降可能反映了截断CTCF阻断凝集素的能力下降（导致绝缘缺陷）和截断CTCF-保护停止的凝集素不被卸载的能力降低（导致DNA环的丢失）。参见补充图6。

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