Apoptosis, the only cell death pathway that can be measured in human diploid dermal fibroblasts following lethal UVB irradiation

doi:10.1038/s41598-020-75873-1

.2020年11月3日；10（1）：18946。

doi:10.1038/s41598-020-75873-1。

凋亡，在致命UVB照射后人类二倍体皮肤成纤维细胞中唯一可以测量的细胞死亡途径

安妮·索菲·加里^1 2, 帕特里克·J·罗切特^三 4 5

附属公司

¹魁北克大学拉瓦尔分校研究中心，Axe Médecine Régénératrice，圣撒克雷姆医院，魁北克省，加拿大。
²加拿大魁北克省魁北克拉瓦尔大学实验室实验室中心。
^三魁北克大学拉瓦尔分校研究中心，Axe Médecine Régénératrice，圣撒克雷姆医院，魁北克省，加拿大。Patrick-J.Rochette@crchudequebec.ulaval.ca。
⁴加拿大魁北克省魁北克拉瓦尔大学实验室实验室中心。Patrick-J.Rochette@crchudequebec.ulaval.ca。
⁵加拿大魁北克省魁北克拉瓦尔大学眼科学与ORL-Chirurgie Cervico-Faciale分部。Patrick-J.Rochette@crchudequebec.ulaval.ca。

PMID： 33144600
预防性维修识别码：项目管理委员会7609555
内政部： 10.1038/s41598-020-75873-1

凋亡，在致命UVB照射后人类二倍体皮肤成纤维细胞中唯一可以测量的细胞死亡途径

安妮·索菲·加里等。科学代表. 2020.

.2020年11月3日；10(1):18946.

doi:10.1038/s41598-020-75873-1。

作者

安妮·索菲·加里^1 2, 帕特里克·J·罗切特^三 4 5

附属公司

¹魁北克大学拉瓦尔分校研究中心，Axe Médecine Régénératrice，圣撒克雷姆医院，魁北克省，加拿大。
²加拿大魁北克省魁北克拉瓦尔大学实验室实验室中心。
^三魁北克大学拉瓦尔分校研究中心，Axe Médecine Régénératrice，圣撒克雷姆医院，魁北克省，加拿大。Patrick-J.Rochette@crchudequebec.ulaval.ca。
⁴加拿大魁北克省魁北克拉瓦尔大学实验室实验室中心。Patrick-J.Rochette@crchudequebec.ulaval.ca。
⁵加拿大魁北克拉瓦尔大学奥夫塔莫洛吉和安大略省高等教育学院。Patrick-J.Rochette@crchudequebec.ulaval.ca。

PMID： 33144600
预防性维修识别码：项目管理委员会7609555
内政部： 10.1038/s41598-020-75873-1

摘要

紫外线辐射（UVR）是一种主要的环境遗传毒剂。在皮肤中，它可以导致形成诱变性DNA损伤。有几种机制可以防止这些DNA损伤转化为皮肤致癌突变。一种重要的突变预防机制是程序性细胞死亡，它可以安全地处理受损的细胞。细胞凋亡是研究最多、特征最好的程序性细胞死亡，但越来越多的新细胞死亡途径正在出现。使用不同的药物性细胞死亡抑制剂和抗氧化剂，我们评估了凋亡、坏死、铁凋亡和parthantos在UVB诱导的人类二倍体皮肤成纤维细胞死亡中的意义。我们的结果表明，凋亡是UVB照射诱导成纤维细胞死亡的唯一已知机制。我们还发现，致命的UVB辐射会导致因NAD+过度使用而导致的PARP依赖性细胞代谢活性的急剧丧失。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
UVB诱导人原代成纤维细胞早期死亡。使用Annexin V-FITC和PI标记，我们评估了20 kJ/m照射后3 h和6 h成纤维细胞的细胞死亡²中波紫外线。通过FACS评估每个细胞的荧光信号。(一)细胞总死亡是Annexin V+/PI−细胞、AnnexinV+/PI+细胞和Annexin-V−/PI+细胞的增加。(b条)PI阳性细胞由PI+/Annexin V+或−细胞组成。(**c（c）**)膜联蛋白V阳性细胞为膜联蛋白V+和PI−。NoUV是未照射的对照细胞。UVB照射成纤维细胞可导致细胞早于3小时死亡。百分比代表至少8000个细胞的群体。N=3，*p值<0.05。

图2
不同细胞死亡抑制剂处理的UVB照射人原代成纤维细胞的细胞代谢活性。在UVB照射之前，将成纤维细胞与不同的细胞死亡抑制剂一起孵育30分钟。然后在PBS中使用致命的UVB剂量（30kJ/m²). 使用的不同细胞死亡抑制剂为：(一)坏死抑制药Necrosulfonamide（NSA，2μM）(b条)铁下垂抑制剂Ferrostatin-1（Ferro-1，5μM）(**c（c）**)宽型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh（QVD，20μM）(d日)PARP抑制剂ABT888（ABT，20μM）或(**e（电子）**)PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-ABA，0.5 mM）。使用MTS测定法在UVB照射后的不同时间点（0、1、3、6、24小时）评估细胞代谢活性。在相同条件的未照射细胞上使照射细胞正常化。NSA和Ferro-1对细胞代谢几乎没有影响。然而，QVD可显著防止UVB诱导的细胞代谢活性在24小时、6小时和24小时的ABT以及3小时和6小时的3-ABA损失。N=4.*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001。(**（f）**)Western Blot证实了ABT888的有效性，显示出抑制PAR形成而不消除凋亡的PARP裂解。

图3
UVB诱导人原代成纤维细胞中细胞代谢活性的两种独立降低。在UVB照射之前，用不同的细胞死亡抑制剂组合培养成纤维细胞30分钟。然后使用致命UVB剂量（30 kJ/m）在PBS中照射细胞²). 使用的组合为：(一)坏死抑制药Necrosulfonamide（NSA，2μM）和caspase抑制剂Q-VD-OPh（QVD，20μM）(b条)铁下垂抑制剂Ferrostatin-1（Ferro-1，5μM）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh（QVD，20μM）(**c（c）**)PARP抑制剂ABT888（ABT，20μM）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh（QVD，20μM）(d日)PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-ABA，0.5 mM）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh（QVD，20μM）。使用MTS分析评估UVB照射后不同时间点（0、1、3、6、24 h）的细胞代谢活性。在相同条件的未照射细胞上使照射细胞正常化。NSA和Ferro-1对QVD引起的细胞代谢活性丧失没有影响。然而，可以描述QVD和PARP抑制剂（ABT和3-ABA）在预防UVB引起的细胞代谢活性损失方面的加性作用。N=4.*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001。

图4
UVB诱导的细胞死亡与人原代成纤维细胞的氧化无关。在UVB照射之前，用不同的抗氧化剂培养成纤维细胞30分钟。然后使用致命UVB剂量（30 kJ/m）在PBS中照射细胞²). 使用的不同抗氧化剂为：(一)广谱氧化抑制剂N个-乙酰半胱氨酸（NAC，2.5 mM）(b条)广谱氧化抑制剂α-生育酚（α-Toco，10μM）(**c（c）**)三重态能量受体山梨酸乙酯（EthS，5μg/μl）。使用MTS分析在UVB暴露后的不同时间点（0、1、6、24小时）评估细胞代谢活性。在相同条件的未照射细胞上使照射细胞正常化。所测试的抗氧化剂均未对UVB诱导的细胞代谢活性损失产生影响。N=4(d日)使用的抗氧化剂、类型和溶解度表。

图5
使用PARP抑制剂可以部分恢复UVB诱导的总NAD和NAD+库减少。在UVB照射之前，用或不用ABT888（ABT，20μM）培养成纤维细胞30分钟。然后用20 kJ/m的紫外线照射细胞²无论PBS中是否存在（UV）（NoUV）。暴露后6 h，收集细胞以量化NAD/NADH。取相同数量的蛋白质来比较不同的条件，即NoUV CTRL、NoUV ABT、UV CTRL和UV ABT(一)总NAD浓度和(b条)测定NADH的浓度。NAD+的浓度通过将NADH减去总NAD得出(**c（c）**). 我们发现，UVB照射可显著降低NAD和NAD+的总量，但使用PARP抑制剂ABT可显著防止这种损失。N=4，*p值<0.05。(d日)NAD+消耗、PARP1和MTS分析之间的联系示意图。

图6
UVB不会在人原代成纤维细胞中诱导Parthanatos。成纤维细胞接受20 kJ/m紫外线照射²（UV）或不（NoUV）。在暴露后的不同时间点，收集细胞（0、1、3、6、9、12 h），分离线粒体、细胞核和细胞质中的蛋白质。使用蛋白质组分对抗AIF的Western Blot(一)线粒体(b条)核心和(**c（c）**)细胞质中没有蛋白质从线粒体转移到细胞核。通过同时扫描3个组分的膜来测量分馏控制。核、细胞溶质和线粒体控制分别为Lamin A/C、Tubulin和AIF。Ponceau染色被用作负荷控制。(d日)30 kJ/m紫外线照射前²，用ABT888（ABT，20μM）、Q-VD-OPh（QVD，20μM）或对照培养基（CTRL）培养细胞30分钟。UVB暴露后，立即用相应的抑制剂和CellTOX染料培养细胞。在不同时间点（0、6、12和24小时）测量与细胞死亡成比例的CellTOX荧光。在相同条件下，将来自未照射细胞（背景）的荧光减去照射细胞。凋亡抑制剂QVD在12和24小时显著防止UVB诱导的细胞死亡。然而，PARP抑制剂ABT对UVB诱导的细胞死亡没有影响。SEM，N=4，*p值<0.05。

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