Impact of wet-dry cycling on the phase behavior and compartmentalization properties of complex coacervates

doi:10.1038/s41467-020-19184-z

.2020年10月27日；11(1):5423.

doi:10.1038/s41467-020-19184-z。

干湿循环对复合凝聚物相行为和分隔性能的影响

哈迪M票价^1 2, 亚历山大·马拉斯^三 4, 杰弗里·M·汀^三 4 5, 马修·维·蒂雷尔^三 4, 克里斯汀·基廷⁶

附属公司

¹宾夕法尼亚州立大学化学系，宾夕法尼亚大学公园，16802，美国。
²美国航空航天局博士后项目，大学空间研究协会，马里兰州哥伦比亚，21046。
^三芝加哥大学普里茨克分子工程学院，伊利诺伊州芝加哥，60637，美国。
⁴美国伊利诺伊州莱蒙特阿贡国家实验室分子工程和材料科学部中心，邮编60439。
⁵3M公司，美国明尼苏达州圣保罗3M中心，邮编：55144。
⁶宾夕法尼亚州立大学化学系，宾夕法尼亚大学公园，16802，美国。keating@chem.psu.edu。

PMID： 33110067
PMCID公司：项目管理委员会7592044
内政部： 10.1038/s41467-020-19184-z

干湿循环对复合凝聚物相行为和分隔性能的影响

哈迪M票价等。国家公社. 2020.

.2020年10月27日；11(1):5423.

doi:10.1038/s41467-020-19184-z。

作者

哈迪M票价^1 2, 亚历山大·马拉斯^三 4, 杰弗里·M·汀^三 4 5, 马修·维·蒂雷尔^三 4, 克里斯汀·基廷⁶

附属公司

¹宾夕法尼亚州立大学化学系，宾夕法尼亚大学公园，16802，美国。
²NASA博士后项目，大学空间研究协会，哥伦比亚，马里兰州，21046，美国。
^三芝加哥大学普里茨克分子工程学院，伊利诺伊州芝加哥，60637，美国。
⁴美国伊利诺伊州莱蒙市阿贡国家实验室分子工程和材料科学部中心，邮编60439。
⁵3M公司，美国明尼苏达州圣保罗3M中心，邮编：55144。
⁶宾夕法尼亚州立大学化学系，宾夕法尼亚大学公园，16802，美国。keating@chem.psu.edu。

PMID： 33110067
PMCID公司：第7592044页
内政部： 10.1038/s41467-020-19184-z

摘要

早期地球上的干湿循环被认为促进了生命分子构建块的产生，但其对自组装和划分的影响在很大程度上仍未被探索。在这里，我们研究了复合凝聚物的脱水/再水化，这些凝聚物是由聚电解质溶液的相分离形成的无膜隔室。确定了十倍失水导致凝聚液滴保持、消失或出现的溶液成分。在整个脱水过程中保持凝聚层的系统被进一步评估，以了解它们的区室化特性如何随着干燥而变化。虽然增加的总RNA浓度增加了十倍，但凝聚物中的RNA浓度保持稳定。随着脱水，外部RNA浓度增加，包封RNA与游离RNA的交换率增加。我们根据相图解释了这些结果，脱水驱动的离子强度增加在确定凝聚特性方面特别重要。这项工作表明，干湿循环可以改变复合凝聚物的相行为和与原细胞相关的功能。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。干燥和再水化控制PDADMA/PAA复合凝聚物的形成。**
一显示干湿循环实验背后动机的方案，即针对化学复杂性的出现而提出的早期地球环境情景。b条在不同电荷和盐浓度下制备的1:1 PDADA:PAA复合凝聚物的浊度值（[单体电荷]根据聚合物重复单元的浓度进行计算）。所有样品均含有25 mM HEPES和4.3 mM MgCl₂。左边的图是低[电荷]样本的放大图。黑色标记表示浊度低于20，这是根据显微镜图像选择的（补充图8）。所有圆圈的宽度与整个样品的浊度值成正比（见上图，T表示透射率）。作为眼睛的引导，一条实心红线划定了两相区和单相区之间的预期边界；这条线是一条近似的双峰曲线。电荷浓度指的是一种聚合物类型，而不是两种聚合物的总量。**c（c）**基于相图上不同起始位置干燥不同1:1 PDADA:PAA凝聚组合物的比较（i=填充三角形，ii=填充方形，iii=填充的菱形，带有开放型-开放三角形、开放方形、开放菱形和虚线箭头，显示预期约10×脱水），时间范围为0–160分钟。在95°C的热块中进行干燥；（i）显示了每个时间点（V）的剩余体积，这是27个样品的平均值（见图2），适用于（ii）和（iii），因为它们具有相同的干燥速度。（ii）中的虚线箭头预计将达到500 mM[NaCl]和150 mM[聚合物电荷]，因此未完全显示。（iv）通过按与顶板相反的顺序添加与每个时间点达到的体积相似的水量，对（i）进行再水化。所有比例尺均为20µm。

**图2。在PDADMA/PAA凝聚悬浮干燥过程中，15聚低聚尿酸U15的分配。**
一每个干燥时间点PDADMA/PAA复合物凝聚的总体积。平均值和标准偏差来自9个独立试验(N个 = 27). 所有样品的起始成分相同：[聚合物电荷]=[NaCl]=5 mM，[HEPES]=2.5 mM，[CgCl₂]=0.43毫米。b条溶液成分浓度的计算增加。标准偏差与用于计算上述体积的试验相同。**c（c）**为了理解RNA在凝聚层中的分配，同时避免在温度诱导的干燥过程中水解的风险，在每个干燥步骤完成后加入Alexa 647标记的U15，并将溶液返回室温。添加荧光剂U15，使其总浓度在干燥步骤中以与溶液中所有其他成分相同的方式增加。U15的总浓度低至0.02µM，从未超过0.2µM，比最低聚合物浓度低约25000倍，据信不会干扰相分离。d日分配系数，计算为[U15]_凝聚层相/【U15】_稀相添加相同摩尔数的荧光RNA后，凝聚体内的U15浓度。从三次试验中获得平均值和标准偏差，每次试验分析五张图像上的15个液滴。**e（电子）**共聚焦荧光显微镜图像显示液滴内的分割U15。当分配系数降低时，内部浓度不会随着d日和补充图14所示。各数据点如补充图14所示。

**图3。干燥过程中复合凝聚态U15的动力学。**
一光漂白后的荧光恢复，FRAP，在整个1:1 PDADMA上：PAA在95°C干燥160分钟的溶液中凝聚液滴，并在将Alexa 647-U15分离之前返回室温。b条在相同温度下干燥80分钟，并在添加U15之前恢复至室温的溶液中部分相同凝聚物上的FRAP。**c（c）**在干燥160分钟的混合物中，在凝聚物中分割的U15的全滴光漂白后荧光的恢复。d日在允许干燥80分钟的混合物中，在凝聚物中分割的U15的粒子液滴光漂白后荧光的恢复。圆形标记表示校正的荧光强度**c、天**。线是根据“方法”部分中提到的方程式拟合的结果。**e（电子）**在干燥实验的每个时间点，U15在整个凝聚液滴漂白后恢复时的表观扩散系数和恢复半衰期。**（f）**U15在每个时间点的部分液滴漂白后恢复时的表观扩散系数和恢复半衰期。条形图是五次试验的平均值，每个试验中至少有两个液滴**e（电子）**.英寸**（f）**，条形图是三个试验的平均值，每个试验中至少分析三个液滴。所有单个数据点如补充表2和3所示，并作为表观扩散系数的灰色标记**e（电子）**和**（f）**误差条表示所有试验的标准偏差。

**图4。重复的干湿循环对复合凝聚的影响。**
一PDADMA/PAA凝聚（[电荷]=[NaCl]=10mM，[HEPES]=5mM，[MgCl₂]=0.9 mM）完全干燥并连续五个循环再水化。该图显示了干燥-复水后的平均重量。b条以Alexa 647-U15为探针，通过共焦显微镜获得的样品再水化后，相同凝聚体中U15的浓度。**c（c）**分配系数K，取[U15]_凝聚层相/【U15】_稀相，在每个循环之后。d日FRAP实验期间荧光恢复的半时间内获得的表观扩散系数，其中含有Alexa 647-U15探针的整个凝聚液滴被漂白。**e（电子）**FRAP实验中的表观扩散系数，其中凝聚相内的直径为1-µm的区域被漂白。中的数据b条–**e（电子）**是两次试验的平均值和标准偏差，分析了总共10个液滴b条，与除以稀释相中的[U15]时使用的值相同**c（c）**，六滴d日和10个液滴内区域**e（电子）**。单个数据点显示为灰色标记。补充表5和6包括所有FRAP拟合参数。

**图5。比较干燥凝聚物和成分模拟样品。**
一通过浊度测量获得的相图上的实线显示了模拟成分的范围。虚线显示了进行SAXS测量的延伸部分（图6）。b条溶液总体积与凝聚相体积比。中的错误栏b条表示±0.25µL的恒定标准偏差，这是肉眼难以识别的体积差异（补充图22）。**c（c）**凝聚体内测得的U15浓度。d日U15的分配系数（[U15]_凝聚层相/【U15】_稀相).e（电子）全液滴FRAP，以及**（f）**干燥PDADMA/PAA中的颗粒液滴FRAP使样品凝聚，并与干燥过程中获得的相同范围内的成分进行模拟。中的误差线**c–f**表示不同试验之间的标准偏差，各个数据点如SI所示（补充图24，补充表8和9）。在**c（c）**，模拟数据表示三次试验的平均值和标准偏差，每次试验在三张图像上分析15个液滴。FRAP模拟数据是从三个试验中获得的平均值和标准偏差，对于全液滴试验，每个试验至少有两个漂白液滴，对于颗粒液滴测量，每个样品有三个漂白区域。上面包括溴酚蓝染干燥样品和模拟样品的照片，以供澄清。

**图6。复杂凝聚体的SAXS数据模拟样品。**
一以50–100 mM聚合物电荷和NaCl制备的PDADMA/PAA复合凝聚样品的小角度X射线散射图，HEPES范围为25至50 mM，MgCl₂对于相同的样品在4.3和8.6mM之间。为了清楚起见，数据垂直移动（补充图26a显示了没有垂直移动的数据）。误差条表示散射测量中的噪声。b条相关长度ξ，从SAXS图的高q区域的统一拟合中获得。各配合如补充图26b所示。从拟合中获得的误差条小于标记，因此不包括在内。其值见补充表11。

**图7。改变相图上运动的方向性。**
一在PDADMA/PAA相图上表示不同组分的实验中，显示盐浓度变化的曲线图。HEPES和氯化镁₂最初添加量为2.5和0.43 mM，并在所有样品中以相同的NaCl增加系数增加年-轴。b条分配系数，取[U15]_凝聚层相/【U15】_稀相对于相同的聚合物浓度，使用不同浓度的盐。**c（c）**相同范围样品的全液滴FRAP实验。插图对应于低浓度样品的放大。补充表12包括所有拟合参数。分区数据是从三个试验中获得的平均值和标准偏差。FRAP的平均值和标准偏差来自三个样品，每个样品有两个漂白液滴。单个数据点显示为灰色标记。

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1. Mamajanov I等人，《干湿循环期间酯的形成和水解：在益生元反应模型中生成远红外平衡聚合物》。大分子。2014;47:1334–1343. doi:10.1021/ma402256d。-内政部
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[2] Forsythe JG等。由干湿循环驱动的酯介导的酰胺键形成：在益生元地球上获得多肽的可能途径。安圭。化学。2015年国际编辑；54:9871–9875. doi:10.1002/anie.201503792。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[4] Mamajanov I等人，《干湿循环期间酯的形成和水解：在益生元反应模型中生成远红外平衡聚合物》。大分子。2014;47:1334–1343. doi:10.1021/ma402256d。-内政部

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