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.2020年10月20日；21(20):7751.
doi:10.3390/ijms21207751。

四个半LIM结构域2（FHL2）参与上皮性卵巢癌的发生

陈旺 1, 吕向民 2 三, 何春波 2 三, 约翰·戴维斯 2 4, 王成（音译） 2 三, 国华华 1
附属公司

四个半LIM结构域2（FHL2）参与上皮性卵巢癌的发生

陈旺等。 国际分子科学杂志. .

摘要

卵巢上皮癌（EOC）是妇科最致命的恶性肿瘤之一。迄今为止，这种致命疾病的病因仍不清楚。FHL2是一个四个半LIM结构域家族的成员，已被证明在各种癌症中起着癌蛋白或抑癌剂的作用。我们之前的研究表明，FHL2通过调节AKT1转录在卵巢颗粒细胞瘤的发生和发展中起着关键作用。然而，FHL2在EOC发生和发展中的直接和系统证据尚不清楚。在本研究中，EOC患者组织的免疫组织化学分析显示，与正常卵巢组织相比，EOC组织中FHL2免疫信号的阳性和强度上调。SKOV-3细胞系中FHL2的敲除降低了细胞生长和细胞活力，阻碍了细胞周期的进展，并抑制了细胞迁移。FHL2在内源性FHL2低的IGROV-1细胞中异位表达，促进细胞生长，提高细胞活力，增强细胞迁移。此外，软琼脂试验表明，敲除SKOV-3细胞系中的FHL2显著抑制凤尾鱼非依赖性生长。相比之下，FHL2在IGROV-1细胞中的过度表达提高了软琼脂中菌落的生长。Western印迹数据显示，FHL2的敲低下调了AKT的表达水平，并上调了凋亡相关蛋白，如裂解的PARP和裂解的层粘连蛋白A。最后，通过使用稳定的SKOV-3/FHL2稳定的敲低细胞系，我们的数据清楚地表明，FHL2的敲低抑制了体内EOC异种移植物的启动。综上所述，我们的结果表明，FHL2通过调节细胞增殖、细胞周期和粘附，在调节EOC的启动和进展中起着关键作用。这些结果表明FHL2可能是治疗EOC药物的潜在靶点。

关键词：FHL2；细胞周期；细胞生长；上皮性卵巢癌；异种移植。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图A1
图A1
通过跨阱分析，FHL2过度表达促进IGROV-1细胞迁移。比例尺：200μm。红色箭头表示迁移的单元格。
图A2
图A2
典型图像显示SKOV-3对照组和稳定的FHL2敲除细胞（shFHL2）的形态学变化。比例尺：200μm。
图1
图1
FHL2蛋白在正常卵巢组织和EOC组织中的表达。(A类)免疫组织化学检测有代表性的图像显示FHL2在正常卵巢组织（左）和上皮性卵巢组织（右）中的表达。FHL2显示为棕色。用苏木精对细胞核进行复染。比例尺：上面板150μm，下面板50μm。(B类)定量数据显示FHL2免疫信号在正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中呈阳性。***表明第页与对照组（Ctrl）相比<0.001。(C类)定量数据显示FHL2在正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中的免疫信号强度。**表明第页与对照组（Ctrl）相比<0.01。
图2
图2
FHL2基因敲除抑制EOC细胞生长并诱导凋亡。(A类)Western blot结果显示FHL2在Hose 969、SKOV-3、IGROV-1、CAOV-3，COV-362、COV-644和A2780细胞系中的表达水平。β肌动蛋白被用作负荷控制。(B类)用2种不同的FHL2 siRNAs（siFHL2-1，siFHL2-2）转染SKOV–3细胞中FHL2蛋白水平。用干扰siRNA转染的SKOV-3细胞作为对照。Western blot结果显示FHL2在SKOV-3对照细胞和FHL2 siRNAs敲除细胞中的表达水平。β肌动蛋白被用作负荷控制。(C类)干扰siRNA（Ctrl）或FHL2 siRNA（siFHL2）转染SKOV-3细胞的形态学变化。比例尺：100μm。(D类)用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒对SKOV-3对照细胞和FHL2敲除细胞（siFHL2）进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。Q1、Q2、Q3和Q4分别表示死亡细胞、早期凋亡细胞、活细胞和晚期凋亡细胞的比例。实验重复至少3次，并显示了具有代表性的图像。(E类)MTT法结果显示，转染2种不同siRNAs（siFHL2-1，siFHL2-2）的SKOV-3对照细胞（Ctrl）和FHL2敲除细胞的活性发生了变化。每个条形代表平均值±标准误差（n=3）。(F类)定量细胞数量以显示FHL2对SKOV-3对照细胞（Ctrl）和用2种不同siRNA转染的FHL2敲除细胞（siFHL2-1，siFHL2-2）的敲除作用。(克)SKOV–3对照（Ctrl）和FHL2敲除细胞（siFHL2）中的细胞周期分布。用碘化丙啶标记对照细胞和处理细胞，并用流式细胞术测定细胞周期分布。每个条形代表平均值±标准误差（n=3）。**表明第页与对照组（Ctrl）相比<0.01，***表示第页与对照组（Ctrl）相比<0.001。
图3
图3
FHL2的异位表达促进EOC细胞生长并诱导细胞形态改变。(A类)IGROV-1细胞转染基于letenvirus-based control vectors（Ctrl）或FHL2过表达载体（FHL2 O/E），β-肌动蛋白作为负荷对照。(B类)典型图像显示IGROV-1对照细胞（Ctrl）和FHL2过度表达细胞（FHL2 O/E）的形态学变化。比例尺：100μm。(C类)IGROV-1对照细胞（Ctrl）和FHL2过表达细胞（FHL2）的生长曲线。每个点代表平均值±S.E.M.***表示第页< 0.001. (D类)定量结果显示IGROV-1对照细胞（Ctrl）和FHL2过表达细胞（FHL2 O/E）中的凋亡细胞、活细胞和死细胞比例。(E类)IGROV-1对照细胞（Ctrl）和FHL2过表达细胞（FHL2 O/E）在血清减少（2%）培养基中培养。然后用Annexin V-APC/PI双重染色试剂盒对细胞进行染色，以进行流式细胞术分析。
图4
图4
FHL2调节EOC细胞中AKT的表达。(A类)Western blot结果显示SKOV-3对照组和FHL2敲除细胞（siFHL2）中FHL2、AKT和凋亡相关蛋白水平。β-微管蛋白用作负荷控制。(B类)Western blot结果显示IGROV-1对照细胞和FHL2过表达细胞（FHL2）中FHL2和AKT的表达水平。β肌动蛋白被用作负荷控制。
图5
图5
FHL2调节EOC细胞的锚定非依赖性生长。(A类)典型图像显示IGROV-1对照组（Ctrl）和稳定的FHL2过表达细胞（FHL2 O/E）的集落形成。(B类)定量分析显示了基于荧光检测的IGROV-1对照细胞和FHL2过表达细胞的非依赖于凤尾鱼的生长差异。(C类)显示SKOV-3对照细胞（Ctrl）和FHL2敲除细胞（siFHL2）克隆形成的代表性图像。比例尺：500μm。(D类)定量分析表明，基于荧光检测，SKOV-3对照细胞（Ctrl）和FHL2敲除细胞（siFHL2）的锚定非依赖性生长存在差异。
图6
图6
FHL2调节EOC细胞的迁移和侵袭。(A类)进行伤口愈合试验，以确定FHL2对SKOV-3细胞迁移的影响。典型图像显示对照细胞（Ctrl，左面板）和FHL2敲除细胞（siFHL2，右面板）的迁移。在测量伤口闭合面积之前，允许细胞迁移15小时。(B类)细胞迁移采用跨阱迁移分析。典型图像显示SKOV–3对照细胞（左）和FHL2敲除细胞（右）的迁移。比例尺：200μm。(C类)用MicrosutTM FIVE软件量化伤口面积。每个条形代表平均值±SEM。***：第页与对照组（Ctrl）相比<0.001。(D类)迁移细胞在显微镜下手动计数。每个条形代表平均值±SEM。***：第页<0.001，与对照组相比。(E类)细胞迁移通过IGROV-1对照（Ctrl）和IGROV-1FHL2过表达细胞（FHL2O/E）的跨阱分析进行评估。每个条形代表平均值±SEM。***：第页< 0.001.
图7
图7
FHL2基因敲除抑制体内EOC肿瘤发生。(A类)用慢病毒非靶向（Ctrl）或FHL2 shRNA载体（shFHL2）转染SKOV-3细胞，构建稳定的细胞株。Western blot结果显示FHL2在对照组（Ctrl）和FHL2敲除稳定细胞（shFHL2）中表达。β肌动蛋白被用作负荷控制。(B类)将转染慢病毒非靶向或FHL2敲除载体（shFHL2）的SKOV-3细胞分别植入裸鼠左右肩部皮下。图像显示裸鼠右肩肿瘤形成（顶面板）。分离并呈现对照组形成的肿瘤（下面板）。FHL2敲除组未发现异种移植物。标尺的最小刻度为mm(C类)生长曲线显示了来源于对照和FHL2敲除细胞（shFHL2）的异种移植物。每个点代表5只小鼠的平均肿瘤体积±S.E.M。(D类)来自对照组和FHL2敲除组（shFHL2）的肿瘤异种移植物重量。每根棒材代表平均值±S.E.M.3。
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