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.2020年10月21日；22(1):251.
doi:10.1186/s13075-020-02331-8。

CXCL1通过CXCR2、c-Raf、MAPK和AP-1途径促进骨关节炎和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中IL-6的表达

盛茂厚 1, 陈伯春 2 三 4, 林玠模 5 6 7, 梅林芳 8 9, 苗清池 10 11 12, 刘菊芳 13
附属机构

CXCL1通过CXCR2、c-Raf、MAPK和AP-1途径促进骨关节炎和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中IL-6的表达

盛茂厚等人。 关节炎研究与治疗. .

摘要

背景：骨关节炎（OA）和类风湿关节炎（RA）是常见的关节疾病，由于其独特的分子机制和发病机制，被视为不同的疾病。趋化因子及其相应受体在RA进展中具有良好的特征，但在OA发病机制中的特征较少。

方法：人原代滑膜成纤维细胞（SFs）取自人OA和RA组织样本。通过Western blot和qPCR分析CXCL1在OASFs和RASFs中的表达水平以及CXCL引起的IL-6的表达。通过使用化学抑制剂、siRNAs和shRNAs鉴定了介导CXCL1促进的IL-6表达的信号级联。

结果：在这里，我们发现这两种疾病的特征是CXCL1和白细胞介素（IL）-6水平升高，这是一种参与OA和RA发病机制的重要促炎细胞因子。在OASFs和RASFs中，CXCL1以剂量和时间依赖性的方式促进IL-6的表达。在过表达CXCL1或用shRNA质粒转导的OASF和RASFs中，IL-6的表达显著上调。发现CXCR2、c-Raf和MAPKs可调节CXCL1诱导的OASFs和RASFs中IL-6的表达。最后，CXCL1触发了OASFs和RASFs中c-Jun（调节促炎蛋白的表达）的转录活性。

结论：我们目前的研究表明，CXCL1/CXCR2轴有助于协调OA和RA SF中的炎症反应。

关键词：CXCL1；IL-6；骨关节炎；类风湿关节炎。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者表示没有利益冲突。

数字

图1
图1
CXCL1表达升高有助于OASFs和RASFs中IL-6的表达。一,b条采用qPCR检测CXCL1和IL-6的表达水平。c（c）–e（电子）CXCL1的蛋白质分泌水平(c（c）)和IL-6(d日)采用ELISA法进行分析。来自同一标本的CXCL1和IL-6分泌水平之间的相关性显示于e（电子）.（f）,克将从所有研究参与者分离的SF与不同浓度（0、1、5和10 ng/mL）的CXCL1孵育24 h。从SF中提取总RNA和细胞裂解物，并使用qPCR和Western blot分析评估IL-6的表达。下面板提供了蛋白质印迹的定量。小时,我用CXCL1（10 ng/mL）处理OASFs和RASFs不同的时间间隔（对照组、6、12和24 h），并用qPCR和Western blot检测IL-6的表达水平。下面板提供了蛋白质印迹的定量。j个–米用CXCL1过表达质粒或shRNA质粒转导OASFs和RASFs 24 h，然后用qPCR检测CXCL1和IL-6的表达。k个用CXCL1中和抗体（100和200 ng/mL）处理OASFs和RASFs 24 h，并用qPCR分析IL-6的表达水平。（在上述实验中，NSF；n个=8，OASF；n个=10，RASF；n个 = 10). 结果表示为平均值±SEM。在涉及两个以上组的实验中，使用单向方差分析和Fisher LSD事后比较测试进行统计分析*第页与NSF组相比<0.05(一–d日)，控制组(（f）–我). 在两组实验中*第页与载体组相比<0.05(j个,k个)，控制shR组(我,米)，或IgG组(n个)
图2
图2
CXCR2负责CXCL1增加OASF和RASF中IL-6的表达。一,b条OASFs和RASFs用CXCR2抑制剂（SB225002，5μM）预处理1 h，然后用CXCL1（10 ng/mL）培养24 h。通过qPCR和Western blot定量IL-6表达水平。下面板提供了蛋白质印迹的定量。c（c）用CXCR2 shRNA质粒转染OASFs和RASFs 24 h（Western blot检测敲除效率），然后用CXCL1处理24 h，用qPCR检测IL-6表达水平。d日将OASF和RASFs与CXCR2抗体孵育，然后用CXCL1处理24小时。通过qPCR测定IL-6的表达水平。（在上述实验中，OASFs；n个 = 10、RASF；n个 = 10). 结果表示为平均值±SEM。使用单向方差分析和Fisher LSD事后比较测试进行统计分析*第页 < 与各数据组相比，0.05（未经治疗）；#第页 < 与对照组相比，0.05(一,b条)，控制shR(c（c）)和IgG(d日)CXCL1孵育后的预处理
图3
图3
c-Raf参与CXCL1在OASF和RASF中增加的IL-6表达。一,b条用c-Raf抑制剂（GW5047，5μM）预处理OASF和RASFs 1小时，然后与CXCL1（10ng/mL）孵育24小时。通过qPCR和Western印迹定量IL-6表达水平。下面板提供了蛋白质印迹的定量。c（c）将OASF和RASF培养不同的时间段（对照组，10、15、30和60分钟）。收集细胞裂解物，用Western blot检测磷酸化c-Raf。下面板提供了蛋白质印迹的定量。d日转染c-Raf shRNA的OASFs和RASFs进一步与CXCL1（10 ng/mL）孵育24 h，然后用qPCR检测IL-6的表达。（敲除效率通过Western blot表示）。e（电子）OASFs和RASFs用CXCR2抑制剂（SB225002，5μM）预处理，并在CXCL1存在下检测c-Raf的磷酸化。下面板提供了蛋白质印迹的定量。（在上述实验中，OASFs；n个 = 10、RASF；n个 = 10). 结果表示为平均值±SEM。使用单向方差分析和Fisher LSD事后比较测试进行统计分析*第页 < 在所有数据中，与各组相比，0.05（对照组和未治疗组）；#第页 < 与对照组相比，0.05(一,b条,e（电子）)和控制shR(d日)CXCL1孵育后的预处理
图4
图4
在OASFs和RASFs中，IL-6的表达需要激活MAPK以响应CXCL1。一,b条OASFs和RASFs用不同的抑制剂进行预处理，这些抑制剂可以阻断各种MAPK信号成分的激活（ERK，PD98059，5μM；甲乙酮，U0126，3μM；JNK，SP600125，3μM；p38，SB203580，5μM）培养1h，然后与CXCL1（10 ng/mL）培养24h。用qPCR和Western blot检测IL-6的表达。下面板提供了蛋白质印迹的定量。c（c）如图3c所示，从OASFs和RASFs收集细胞裂解物，Western blot分析通过监测这些蛋白的磷酸化形式评估MEK、ERK、JNK和p38的活化。下面板提供了蛋白质印迹的定量。（在上述实验中，OASF；n个 = 10、RASF；n个 = 10). 结果表示为平均值±SEM。使用单向方差分析和Fisher LSD事后比较测试进行统计分析*第页 < 在所有数据中，与各组相比，0.05（对照组和未治疗组）；#第页 < 与对照预处理组和CXCL1孵育组相比，0.05
图5
图5
AP-1转录因子介导OASFs和RASFs中对CXCL1反应的IL-6表达。一,b条用不同的AP-1活化抑制剂（丹参酮，5μM；姜黄素，3μM）培养1h，然后用CXCL1（10 ng/mL）培养。用qPCR和Western blot检测IL-6的表达。蛋白质印迹的定量在下面板中提供。c（c）如图3c所示，从OASF和RASF中收集细胞裂解物，然后通过蛋白质印迹研究c-Jun磷酸化。下面板提供了蛋白质印迹的定量。d日用c-Jun siRNA转染OASFs和RASFs 24 h，然后用CXCL1（10 ng/mL）处理24 h。用qPCR分析IL-6的表达。e（电子）用靶向CXCR2（SB225002，5μM）、c-Raf（GW5047，5μM）、ERK（PD98059，5μL）、MEK（U0126，3μM），JNK（SP600125，3μL）和p38（SB203580，5μR）的抑制剂预处理OASF 1 h，然后用CXCL1（10 ng/mL）再培养24 hh.使用c-Jun抗体进行免疫荧光染色，监测核移位。（在上述实验中，OASFs；n个 = 10、RASF；n个 = 10). 结果表示为平均值±SEM。使用单向方差分析和Fisher LSD事后比较测试进行统计分析*第页 < 在所有数据中，与各组相比，0.05（对照组和未治疗组）；#第页 < 与对照组相比，0.05(一)和控制siR(b条)CXCL1孵育后的预处理
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