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.2020年10月13日；12（24）：24967-24982。
doi:10.18632/aging.103767。 Epub 2020年10月13日。

HBXIP促进胃癌通过METTL3介导的MYC mRNA m6A修饰

芷阳 1, 小弟江 2, 李德铭（Deming Li） 三, 姜晓峰 1
附属公司

HBXIP促进胃癌通过METTL3介导的MYC mRNA m6A修饰

芷阳等。 老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. .

摘要

胃癌（GC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，即使在中国等国家，其治疗方案也有限，地理分布也不同。其致癌过程中的基因改变急需阐明。在这项研究中，我们提出了一个有趣的假设，即乙型肝炎X相互作用蛋白（HBXIP）可能在GC中作为癌基因发挥作用。我们采集了45个GC组织，并对癌旁组织进行了匹配。通过m6A RNA免疫沉淀和斑点分析检测c-myc原癌基因（myc）N6-甲基腺苷（m6A）mRNA甲基化。HBXIP、甲基转移酶样3（METTL3）和MYC的表达均在GC组织和细胞中上调。沉默HBXIP会导致METTL3表达降低，从而抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭，同时促进其凋亡。此外，METTL3增强了MYC m6A甲基化和MYC翻译，这可能会增强GC细胞的增殖、迁移和侵袭。最后，HBXIP敲除阻碍了GC细胞的致瘤性体内根据本研究的结果，我们得出结论，HBXIP在GC中起致癌作用通过METTL3介导的MYC mRNA m6A修饰。该研究全面了解了HBXIP作为限制GC进展的潜在治疗靶点。

关键词：乙型肝炎X相互作用蛋白；METTL3；MYC；N6-甲基腺苷甲基化；胃癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：这些作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
HBXIP表达模式在GC组织和细胞系中上调。(A类)在TCGA数据库中分析肿瘤组织和匹配正常组织中HBXIP的表达模式。左边的红色框表示肿瘤样本，右边的灰色框表示正常样本。肿瘤样本和正常样本的数量标记如下。(B类)用RT-qPCR测定GC和癌旁组织（n=45）中HBXIP mRNA的表达，并将其归一化为GAPDH*第页< 0.05与。癌旁组织。(C类)HBXIP蛋白的代表性Western blots及其在GC和癌旁组织（n=45）中的定量，按照GAPDH标准化*第页< 0.05与。癌旁组织。(D类和E类)用RT-qPCR检测GC细胞和正常细胞中HBXIP mRNA表达和蛋白表达模式(D类)和Western blot分析(E类)，按照GAPDH标准化#第页< 0.05与。GES-1细胞系。上述数据为测量数据，表示为平均值±标准偏差。面板中的数据(B类和C类)按配对进行比较t吨测试和面板内(D类和E类)通过单向方差分析和Tukey的事后检验。细胞实验独立重复3次。
图2
图2
沉默HBXIP抑制GC细胞的活力、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。(A类)HBXIP沉默后AGS和MKN-45细胞中HBXIP蛋白的代表性蛋白质印迹及其定量，归一化为GAPDH。(B类)CCK-8用于检测HBXIP沉默后AGS和MKN-45细胞的增殖。(C类)采用Transwell法检测HBXIP沉默（×200）后AGS和MKN-45细胞的迁移和侵袭能力。(D类)流式细胞术检测HBXIP沉默后AGS和MKN-45细胞的凋亡*第页< 0.05与。sh-NC组（经sh-NC处理的AGS或MKN-45细胞）。上述数据为测量数据，表示为平均值±标准偏差。面板中的数据(A类,C类和D类)采用Tukey事后检验进行单因素方差分析，采用Bonferroni事后检验对B组进行重复测量方差分析。细胞实验独立重复3次。
图3
图3
沉默HBXIP可降低METTL3的表达模式，抑制GC细胞的存活、迁移和侵袭，并诱导凋亡。(A类)METTL3在GC中的表达模式如TCGA数据库所示。左侧红色方框图表示肿瘤样本，右侧灰色方框图表示正常样本。肿瘤样本和正常样本的数量标记如下。(B类和C类)用RT-qPCR检测胃癌和癌旁组织中METTL3 mRNA表达和蛋白表达模式(B类)和Western blot分析(C类)，按照GAPDH标准化&第页< 0.05与。癌旁组织。D类和E类RT-qPCR检测GC细胞METTL3 mRNA表达和蛋白表达(D类)和Western blot分析(E类)，按照GAPDH标准化&第页< 0.05与。GES-1细胞。(F类)沉默HBXIP后，通过Western blot分析检测METTL3蛋白表达，并将其归一化为GAPDH。G、 沉默METTL3后，通过Western blot分析检测METTL4蛋白表达，并将其归一化为GAPDH。(H（H）)通过CCK-8检测METTL3沉默后AGS和MKN-45细胞的活性。(我)METTL3沉默（×200）后，用Transwell法检测AGS和MKN-45细胞的迁移和侵袭。(J型)流式细胞术检测METTL3沉默后AGS和MKN-45细胞的凋亡。(K（K）)METTL3和HBXIP蛋白的代表性蛋白质印迹及其在AGS和MKN-45细胞中HBXIP沉默或与METTL3-过度表达结合后的定量，归一化为GAPDH。
图3
图3
沉默HBXIP可降低METTL3的表达模式，抑制GC细胞的存活、迁移和侵袭，并诱导凋亡。(我)通过CCK-8测定检测AGS和MKN-45细胞在HBXIP沉默或与METTL3过表达联合时的生存能力。(M（M）)HBXIP沉默或结合METTL3过表达（×200）后，通过Transwell分析检测AGS和MKN-45细胞的迁移和侵袭。(N个)流式细胞术检测HBXIP沉默或与METTL3过度表达联合后AGS和MKN-45细胞的凋亡*第页< 0.05与。sh-NC或sh-NC和oe-NC组（用sh-NC或sh-NC和oe-NC两者处理的AGS或MKN-45细胞）#第页< 0.05与。sh-HBXIP和oe-NC组（经sh-HBXIP和oe-NC处理的AGS或MKN-45细胞）。上述结果为测量数据，表示为平均值±标准差。面板中的数据B类和C类按配对进行比较t吨测试，在面板中(D类——G公司,我——K（K）,M（M）和N个)采用Tukey的事后检验和面板内的单因素方差分析H（H）和我通过重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验。细胞实验独立重复3次。
图4
图4
沉默METTL3可减少MYC mRNA m6A的修饰，并阻碍GC细胞中MYC的表达模式。(A类)用斑点杂交法检测GC组织（n=45）和GC细胞中m6A修饰水平*第页< 0.05与。癌旁组织或GES-1细胞。(B类)TCGA数据库中GC中METTL3和MYC的共同表达。每个点代表一个样本，横坐标表示METTL3表达模式，纵坐标表示MYC表达模式，左上角表示相关系数和第页值。(C类和D类)采用RT-qPCR方法检测胃癌和癌旁组织（n=45）中MYC mRNA表达和蛋白表达模式(C类)和Western blot分析(D类)，归一化为GAPDH，表示为平均值±标准偏差，并用成对检验t吨-测试*第页< 0.05与。癌旁组织。(E类和F类)用RT-qPCR检测AGS和MKN-45细胞中MYC mRNA表达和蛋白表达模式(E类)和Western blot分析(F类)，标准化为GAPDH。(G公司)沉默METTL3后，根据GAPDH标准化的AGS和MKN-45细胞中MYC蛋白的代表性蛋白质印迹及其定量。(H（H）)用Me-RIP和RT-qPCR检测沉默METTL3后AGS和MKN-45细胞中MYC mRNA的m6A水平。(我)METTL3沉默后，通过PAR-CLIP分析评估GC细胞中METTL3~MYC mRNA的结合。上述结果为测量数据，表示为平均值±标准偏差。面板中的数据A类（左）(C类和D类)按配对进行比较t吨测试和面板中A类（中间和右边）和(E类——我)通过单向方差分析和Tukey的事后检验。细胞实验独立重复3次。
图5
图5
METTL3通过介导MYC mRNA m6A修饰抑制GC细胞存活、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。(A类)MYC蛋白的代表性蛋白质印迹及其在用oe-MYC处理或与sh-METTL3-1组合的GC细胞中的定量，标准化为GAPDH。(B类)用Me-RIP和RT-qPCR检测oe-MYC处理或与sh-METTL3-1联合处理的GC细胞中MYC-mRAN的m6A水平。(C类)在用oe-MYC处理或与sh-METTL3-1组合的GC细胞中，通过PAR-CLIP测定评估METTL3与MYC mRNA的结合。(D类)CCK-8用于检测oe-MYC处理或与sh-METTL3-1联合处理的GC细胞的增殖情况。(E类)使用Transwell检测oe-MYC处理或与sh-METTL3-1（×200）联合处理的GC细胞的迁移和侵袭。(F类)流式细胞术检测oe-MYC处理或与sh-METTL3-1联合处理的GC细胞的凋亡情况*第页< 0.05与。oe-NC组（经oe-NC处理的GC细胞）#第页< 0.05与。sh-NC+oe-MYC组（用sh-NC和oe-MYC处理的GC细胞）。上述数据均为测量数据，以平均值±标准偏差表示。面板中的数据(A类——C类,E类和F类)采用Tukey的事后检验进行单向方差分析，并在D组中采用Bonferroni事后检验进行重复测量方差分析。细胞实验独立重复3次。
图6
图6
沉默HBXIP损害METTL3介导的MYC m6A mRNA修饰在体外.(A类)HBXIP、METTL3和MYC蛋白的代表性蛋白质印迹及其在经sh-HBXIP、oe-METTL4或两者处理的AGS和MKN-45细胞中的定量，归一化为GAPDH。(B类)用Me-RIP和RT-qPCR检测经sh-HBXIP、oe-METTL3或两者处理的AGS和MKN-45细胞中MYC mRNA的m6A水平。(C类)在用sh-HBXIP、oe-METTL3或两者处理的GC细胞中，通过PAR-CLIP分析评估METTL3~MYC mRNA的结合*第页< 0.05与sh-NC和oe-METTL3组（用sh-NC与oe-NC处理AGS或MKN-45细胞#第页< 0.05与。sh-HBXIP+oe-NC组（经sh-HBXIP和oe-NC处理的AGS或MKN-45细胞）&第页< 0.05与。sh-NC+oe-METTL3组（用sh-NC和oe-METL3处理AGS或MKN-45细胞）。上述结果为测量数据，以平均值±标准偏差表示，并使用单向方差分析与Tukey的事后检验进行比较。细胞实验独立重复3次。
图7
图7
通过沉默HBXIP抑制GC异种移植物的生长体内.(A类)注射MKN-45细胞的裸鼠移植瘤的代表性图像。(B类)每3天监测注射MKN-45细胞的裸鼠移植瘤体积。(C类)注射MKN-45细胞的裸鼠移植瘤重量*第页< 0.05与。sh-NC组（裸鼠注射sh-NC处理的MKN-45细胞）。测量数据表示为平均值±标准偏差。面板中的数据(C类)被未配对的人比较t吨-通过重复测量ANOVA和Bonferroni事后检验对B组进行测试。n＝6。
图8
图8
机制图显示，HBXIP通过介导METTL3介导的MYC mRNA的m6A修饰来增加MYC的表达模式，从而促进GC的发生和发展。
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参考文献

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