跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2020年9月9日；54(5):853-874.
doi:10.33594/000000274。

H9c2细胞中VDAC1基因敲除通过线粒体己糖激酶II结合减少和糖酵解应激增强促进氧化应激诱导的细胞凋亡

杨美英 1, 孙杰（音译） 1 2, 大卫·F·斯托 1 三 4 5, 埃马德·塔伊霍斯德 6 7, 魏梦国 1 5 8 9, Amadou K S Camara公司 10 4 5 8
附属公司

H9c2细胞中VDAC1基因敲除通过线粒体己糖激酶II结合减少和糖酵解应激增强促进氧化应激诱导的细胞凋亡

杨美英等。 细胞生理生化. .

摘要

背景/目的：最丰富的线粒体外膜蛋白VDAC1在细胞死亡中的作用取决于细胞类型和刺激。在各种类型的癌细胞株中，VDAC1的沉默和上调都可以刺激细胞凋亡。相反，在小鼠胚胎干细胞（MES）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，VDAC1基因敲除（VDAC1）的作用-/-)在凋亡细胞死亡方面是矛盾的。VDAC1的贡献和潜在机制-/-在氧化应激诱导的心肌细胞死亡中尚未确定。我们假设VDAC1是氧化应激诱导H9c2细胞死亡的重要调节因子。

方法：我们用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除了大鼠成心肌细胞系中的VDAC1，以产生VDAC1-/-H9c2细胞，并通过MTT法测定细胞活力，TUNEL染色法测定细胞死亡和LDH释放，确定VDAC1是否通过叔丁基过氧化氢（tBHP）、有机过氧化物或鱼藤酮（ROT）（线粒体复合物I抑制剂）诱导的氧化应激促进细胞死亡。通过测量O来检测线粒体和糖酵解应激2Seahorse XFp分析仪的消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。

结果：我们发现在控制条件下，VDAC1-/-不影响H9c2细胞增殖或线粒体呼吸。然而，与野生型（WT）细胞相比，暴露于tBHP或ROT都会增加ROS、ECAR和质子（H+)糖酵解产生率（PPR）以及促进VDAC1细胞凋亡-/-H9c2细胞。VDAC1型-/-H9c2细胞还表现出线粒体结合己糖激酶II（HKII）和Bax显著降低。VDAC1中VDAC1的恢复-/-H9c2细胞恢复了线粒体结合的HKII，同时降低了tBHP和ROT诱导的ROS生成和细胞死亡。有趣的是，在VDAC1中tBHP处理后线粒体呼吸保持不变-/-和WT H9c2细胞。

结论：我们的结果表明VDAC1-/-H9c2细胞中，氧化应激介导的细胞凋亡增强，该凋亡与线粒体结合的HKII减少直接相关，同时与ROS生成、ECAR和PPR增强相关。

关键词：VDAC1淘汰赛；氧化应激；线粒体结合己糖激酶II；细胞外酸化；细胞死亡/凋亡；巴西。

PubMed免责声明

利益冲突声明

关于任何利益冲突，提交人没有任何可披露的内容。

数字

图1。
图1。
VDACl的生成和识别−/−H9c2细胞。（A） 大鼠VDACl基因组图以及大鼠基因组中两个单导向（sg）RNA的位置和序列。（B） sgRNA、T7启动子、CRISPR引导RNA和Cas9蛋白的复合物形成图。（C） 选定VDAC1的基因突变序列−/−来自sgRNA1和sgRNA2的H9c2细胞克隆。（D） VDAC1 DNA测序痕迹的比对−/−C3至WT H9c2细胞。框中的箭头表示VDAC1中的单核苷酸T缺失−/−C3 H9c2细胞克隆。（E） 选定WT和VDAC1的Western blot分析−/−具有VDAC1特异性和Tom-20（负载控制）抗体的H9c2细胞克隆。（F） 选定WT和VDAC1的Western blot分析−/−含有VDAC2、VDAC3和β-微管蛋白（负荷控制）抗体的H9c2细胞克隆。
图2。
图2。
WT和VDAC1的线粒体形态和质量特征−/−H9c2细胞。（A） WT和VDAC1的免疫染色−/−带有COX IV抗体的C1 H9c2细胞。（B） 直方图显示了20个细胞/组的两个线粒体形状指标的平均值，长宽比（左侧面板）和形状因子（右侧面板）。*#与WT相比P<0.05。（C）直方图显示WT和VDAC1实时PCR检测到的mtDNA Ct/β-actin DNA Ct的相对比率−/−C1、C2和C3 H9c2细胞。*与WT相比，P<0.05。
图3。
图3。
WT和VDAC1线粒体生物能量学特征−/−H9c2细胞。（A） 细胞线粒体应激试验剖面图。（B） O的痕迹2WT和VDAC1中的消耗率（OCR）−/−正常条件下，使用Seahorse XFp分析仪测量C1、C2和C3 H9c2电池。（C） WT和VDAC1的基础呼吸、最大呼吸、ATP生成和备用呼吸容量的个体参数−/−C1、C2和C3 H9c2细胞。数据表示为平均值±SEM，n=8个来自2个独立实验的井。
图4。
图4。
tBHP或ROT诱导WT和VDAC1细胞活力和细胞死亡−/−H9c2细胞。（A） WT和VDAC1的MTT分析（细胞活力）−/−暴露于不同浓度tBHP 20 h后的C1、C2和C3 H9c2细胞。（B） WT和VDAC1的TUNEL测定−/−暴露于不同浓度tBHP 20小时后的C1 H9c2细胞。（C） WT和VDAC1的代表性TUNEL染色（细胞死亡）−/−暴露于125μM tBHP 20 h后的C1 H9c2细胞。凋亡细胞核TUNEL染色（红色），DAPI（蓝色）复染以标记细胞核。红蓝融合细胞计数为TUNEL阳性细胞。（D） WT、VDAC1的LDH释放−/−在VDAC1中恢复C1、C2、C3和VDAC1−/−暴露于50，100μM tBHP 3 h后的C1 H9c2细胞。（E） WT和VDAC1的MTT测定−/−C1、C2和C3 H9c2细胞暴露于不同浓度的ROT 48小时后的存活率*与WT相比P<0.05，#与VDAC1相比P<0.05−/−每个实验重复三次。
图5。
图5。
WT和VDAC1线粒体呼吸测定−/−C1 H9c2细胞暴露于tBHP。（A） O的痕迹2WT和VDAC1中的消耗率（OCR）−/−C1 H9c2细胞接触或不接触tBHP。（B） WT和VDAC1中的OCR总结−/−C1 H9c2细胞接触或不接触tBHP。（C） WT和VDAC1中的质子泄漏和（D）耦合效率−/−C1 H9c2细胞接触或不接触tBHP。NS：不显著。
图6。
图6。
WT和VDAC1中的ROS生成−/−和VDAC1恢复VDAC1−/−C1 H9c2细胞暴露于tBHP或鱼藤酮与H2DCFDA染色。（A） WT、VDAC1−/−C1、C2和VDAC1−/−C1+恢复暴露于50μM tBHP的VDAC1 H9c2细胞。（B） WT、VDAC1−/−C1和VDAC1−/−C1+修复暴露于50μM鱼藤酮的VDAC1 H9c2细胞*与VDAC1相比P<0.05−/−C1+TBHP。每个实验重复三次。
图7。
图7。
线粒体结合的HKII对tBHP诱导的WT和VDAC1细胞死亡的影响−/−H9c2细胞。（A） WT和VDAC1中HKII水平的Western blot分析−/−来自总细胞裂解液的H9c2细胞。以β-微管蛋白水平作为蛋白负荷控制。（B） WT和VDAC1线粒体HKII水平的Western blot分析−/−H9c2细胞。（C） WT和VDAC1线粒体HKII水平的Western blot分析−/−C1 H9c2细胞暴露于tBHP。（D） WT、VDAC1线粒体和细胞溶质组分中HKII水平的Western blot分析−/−C1和VDAC1−/−C1+恢复VDAC1 H9c2细胞*与WT相比，P<0.05。每个实验重复三次。
图8。
图8。
WT和VDAC1中的糖酵解应激−/−H9c2细胞暴露于tBHP。WT和VDAC1中OCR（A）和ECAR（B）轨迹的变化−/−C1、C2和C3 H9c2细胞未暴露或暴露于tBHP 20 h。数据表示为平均值±SEM，n=8孔，来自2个独立实验*与WT+tBHP相比，P<0.05。（C） 总质子产率（PPR总数)以及PPR各自的贡献resp（响应）和PPR甘氨酸在WT和VDAC1中添加葡萄糖（中间面板）和寡霉素（底部面板）之前和之后−/−C1 H9c2细胞未接触或接触tBHP*与VDAC1相比，P<0.05 WT+tBHP−/−+t制动马力。
图9。
图9。
VDAC 1的影响−/−从WT和VDAC1分离的线粒体（A）和细胞质（B）中Bax水平的Western blot分析−/−用或不用20μM ROT处理C1 H9c2细胞20 h。COX IV、GAPDH和β-微管蛋白用作蛋白质负荷控制以及线粒体和细胞溶质标记物。*与WT非ROT相比P<0.05。#与VDAC1相比P<0.05−/−C1非旋转。每个实验重复三次。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Camara AK，Bienengraeber M，Stowe DF：线粒体保护心肌缺血和再灌注损伤的方法。《前沿生理学》2011；2:13.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Camara AK，Lesnefsky EJ，Stowe DF：针对线粒体的策略的潜在治疗益处。Antioxid Redox Signal 2010；13:279–347.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Das S，Steenbergen C，Murphy E：电压依赖性阴离子通道是否调节心脏缺血再灌注损伤？2012年生物化学与生物物理学学报；1818:1451–1456.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. McCommis KS，Baines CP：VDAC在细胞死亡中的作用：朋友还是敌人？2012年生物化学与生物物理学学报；1818:1444–1450.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Shoshan-Barmatz V，Ben-Hail D:VDAC，一种多功能线粒体蛋白作为药理靶点。线粒体2012；12:24–34.-公共医学