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.2020年8月21日；12(9):2370.
doi:10.3390/cancers12092370。

新型咖啡酸苯乙酯-莫特林抗体纳米粒增强肿瘤细胞的选择性细胞毒性

贾旺 1 2, 普里扬舒·巴加瓦 1, 岳瑜 1 三, 安妮莎·诺菲塔·萨里 1, 张华岳 1, 石井Noriyuki 1, 严康民 1, 张振亚 2, 石田良久 4, 寺尾敬二 4, 苏尼尔·考尔 1 5, 宫口英二 6, 雷努·瓦德瓦 1
附属公司

新型咖啡酸苯乙酯-莫特林抗体纳米粒增强肿瘤细胞的选择性细胞毒性

贾旺等。 癌症（巴塞尔）. .

摘要

咖啡酸苯乙酯（CAPE）是蜂胶的关键生物活性成分，具有抗癌活性。由于mothalin是一种hsp70伴侣蛋白，在癌细胞表面富集，因此我们招募了一种独特的细胞内吞抗mothalin-抗体（MotAb）来生成靶向mothlin的CAPE纳米颗粒（CAPE-MotAbs）。生物物理和生物分子分析显示CAPE-MotAb在体外和体内的抗癌活性增强。我们证明，CAPE-MotAb通过下调Cyclin D1-CDK4、磷酸化Rb、PARP-1和抗凋亡蛋白Bcl2，导致癌细胞更强的剂量依赖性生长停滞/凋亡。同时，p53、p21的表达显著增加WAF1（加权平均1）并且只有CAPE-MotAb处理的细胞才能获得caspase裂解。我们还证明CAPE-MotAb显著增强了与细胞迁移密切相关的蛋白质的下调。裸鼠皮下异种移植的体内肿瘤生长试验也显示，治疗组的肿瘤生长抑制显著增强，这表明这些新型CAPE-MotAb纳米颗粒可能是一种有效的抗癌纳米药物。

关键词：CAPE；肿瘤治疗；增强给药；内化抗体；莫特林；纳米颗粒。

PubMed免责声明

利益冲突声明

石田义久和Terao隶属于CycloChem Co.，Ltd.，7-4-5 Minatojima-minamimachi，Chuo-ku，Kobe 650-0047，Japan。提交人声明不存在利益冲突。

数字

图1
图1
靶向药物递送用CAPE-MotAb纳米粒的结构和特性示意图。(A类)用DSPE-PEG-NHS修饰的MotAb。(B类)由两亲性嵌段共聚物（DSPE-PEG-NHS）与MotAb自组装形成的以砂浆为靶向的CAPE-MotAbs纳米粒子的结构。(C)CAPE-MotAb靶向治疗癌症的一般机制：通过EPR效应实现的被动靶向作用，使血液循环时间较长的纳米胶囊积聚在肿瘤区域，随后通过迫害素介导的内吞作用被肿瘤细胞内吞。内切体/溶酶体中的低pH值为CAPE通过分解胶束逃逸到细胞质提供了最佳环境，从而导致细胞死亡。(天)CAPE、DSPE-PEG-NHS、CAPE-PEG、MotAb和CAPE-MotAb.的非还原性SDS-PAGE分析。MotAb出现在分子量约250-kDa处，CAPE-MotAb出现在较高分子量处，表明MotAbs与DSPE-PEG-NHS成功结合。(E类)CAPE-MotAb的UV-Vis-NIR吸收光谱。在CAPE-MotAb中同时观察到280nM的MotAb和335nM的CAPE的特征峰（用黑色箭头标记），显示CAPE在聚合物胶束中的成功包封。(F类)CAPE MotAb的代表性TEM图像（放大插图显示在右上角）。(G公司)CAPE-MotAb的定量粒径分布呈单分散球形，直径为9至19 nM。
图1
图1
靶向药物递送用CAPE-MotAb纳米粒的结构和特性示意图。(A类)用DSPE-PEG-NHS修饰的MotAb。(B类)由两亲性嵌段共聚物（DSPE-PEG-NHS）与MotAb自组装形成的以砂浆为靶向的CAPE-MotAbs纳米粒子的结构。(C)CAPE-MotAb靶向治疗癌症的一般机制：通过EPR效应实现的被动靶向作用，使血液循环时间较长的纳米胶囊积聚在肿瘤区域，随后通过迫害素介导的内吞作用被肿瘤细胞内吞。内切体/溶酶体中的低pH值为CAPE通过分解胶束逃逸到细胞质提供了最佳环境，从而导致细胞死亡。(天)CAPE、DSPE-PEG-NHS、CAPE-PEG、MotAb和CAPE-MotAb.的非还原性SDS-PAGE分析。MotAb出现在分子量约250-kDa处，CAPE-MotAb出现在较高分子量处，表明MotAbs与DSPE-PEG-NHS成功结合。(E类)CAPE MotAb的紫外-可见-近红外吸收光谱。在CAPE-MotAb中同时观察到280 nM的MotAbs和335 nM的CAPE的特征峰（用黑色箭头标记），表明CAPE在聚合物胶束中成功包裹。(F类)CAPE-MotAb的典型TEM图像（放大的插图显示在右上角）。(G公司)CAPE-MotAb的定量粒径分布呈单分散球形，直径为9至19 nM。
图2
图2
不同癌细胞系中莫他林的细胞表面表达。(A类)莫特林的平均荧光强度（MFI）。FACS分析显示，尽管在不同的癌细胞中，莫特林在细胞表面有不同程度的表达。值表示为中值。(B类)HCT116、HT-29和A549细胞质膜组分中莫他林的蛋白质印迹显示；NaK-ATP酶和Ezrin分别作为负荷控制和无关膜蛋白控制。右侧显示了三个独立实验的Western blotting定量数据（平均值±SD，n个= 3), *第页< 0.05, ***第页<0.001（学生t检验）。
图3
图3
增强CAPE-MotAb的体外选择性细胞毒性。(A类)细胞活性测定表明，CAPE-PEG和CAPE-MotAb对A549癌细胞的杀伤作用呈剂量依赖性，CAPE-Mot Ab增强了CAPE对A549细胞的杀伤活性，但对MRC5正常细胞没有增强作用(B类)（平均值±SD，n个= 3), ***第页<0.001（学生t检验）。(C)显示CAPE-MotAb（CAPE浓度：20μg/mL）对人类癌细胞毒性的相控图像；培养24小时后，MRC5正常细胞未表现出明显毒性。(天)在用CAPE-MotAb（CAPE浓度：20μg/mL）处理的细胞中观察到较强的集落形成能力下降。来自三个独立实验的定量（平均值±SD，n个= 3), **第页<0.01（学生t检验）。(E类)用CAPE-PEG和CAPE-MotAb处理A549细胞48 h后的细胞活力（平均值±SD，n个= 3), *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001（学生t检验）。CAPE-MotAb导致细胞存活率的剂量依赖性下降，部分因预培养/与MotAbs同时培养而受损。
图4
图4
靶向莫他林在癌细胞中选择性摄取CAPE-MotAb。(A类)用CAPE-PEG和CAPE-MotAb处理A549和MRC5细胞，然后用Alexa Fluor染色的荧光显微镜图像TM（TM）594标记的二级抗体。细胞核用Hoechst染色。在A549细胞中观察到CAPE-MotAb的细胞摄取效率较高。(B类)荧光图像中莫特林表达的定量（平均值±SD，n个= 3), ***第页<0.001（学生的t吨-测试）。(C)定量分析A549和MRC5细胞对CAPE-PEG和CAPE-MotAb的细胞摄取（平均值±SD，n个= 3), ***第页<0.001（学生的t吨-测试）。与同样纳米粒子处理的MRC5细胞相比，CAPE-MotAb处理的A549细胞显示出更高的CAPE积累。用等量的CAPE（20µg/mL）处理所有上述实验的A549和MRC5细胞12小时。
图5
图5
CAPE-MotAb在A549细胞中诱导更强的细胞周期阻滞和凋亡。(A类)CAPE-MotAb处理的A549细胞在培养24小时后的细胞周期分析显示，与CAPE-PEG处理的A548细胞相比，G2/M期的细胞数量增加。三个独立实验的细胞群定量。(B类)细胞周期调节蛋白（p53，p21）的Western blotWAF1（加权平均1）、细胞周期蛋白D1、CDK4和pRb）。结果定量显示在右侧（平均值±SD，n个= 3), **第页< 0.01, ***第页<0.001（学生t检验对照）。(C)48小时孵育后流式细胞仪的凋亡分析显示，经CAPE-MotAb处理后，凋亡细胞急剧增加。三个独立实验中凋亡细胞的定量（平均值±SD，n个= 3), **第页<0.01（学生t检验）。(天)细胞与CAPE-MotAb孵育48小时后，对凋亡蛋白（PARP-1、Bcl-2、前钙蛋白酶3、前钙酶9、细胞色素C和Bax）进行Western blot。结果定量显示在右侧（平均值±SD，n个= 3), **第页< 0.01, ***第页<0.001（对照组的学生t检验）。在所有上述实验中，用等量的CAPE（10µg/mL）处理A549细胞。
图6
图6
CAPE-MotAb具有增强的抗迁移和抗入侵活性。(A类)伤口划痕试验显示，与其他两组相比，CAPE-MotAb处理的A549细胞移动较慢，如伤口开放区域所示（CAPE浓度：5μg/mL）。三个独立实验的开放面积定量（平均值±SD，n个= 3), *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001（学生t检验对照）。(B类)侵袭试验的代表性图像显示CAPE-MotAb处理的A549细胞侵袭受损。细胞侵袭的定量来自三个独立实验（平均值±SD，n个= 3), ***第页<0.001（学生t检验）。用等量的CAPE（10µg/mL）处理A549细胞24小时(C)用CAPE-MotAb（10µg/mL）培养细胞48小时后，对转移相关蛋白（MMP2、MMP3、MMP9、hnRNP-k、CARF和Vimentin）进行Western blot分析。结果定量显示在右侧（平均值±SD，n个= 3), *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001（学生t检验对照）。
图7
图7
增强体内条件下CAPE-MotAb的选择性肿瘤抑制活性。(A类)对照组、CAPE组和CAPE-MotAb组小鼠A549细胞的相对肿瘤体积（平均值±SD，n个= 4), ***第页<0.001（学生t检验）。与对照组和CAPE治疗组相比，经CAPE-MotAb治疗的携带A549异种移植物的裸鼠的成瘤能力显著降低。(B类)图像显示，与其他两组相比，使用CAPE-MotAb治疗后肿瘤体积减少更大。(C)在治疗期间，未观察到体重的显著变化。平均重量(天)和图像(E类)在实验终点解剖的A549异种移植瘤（平均值±SD，n个= 4), **第页< 0.01, ***第页<0.001（学生t检验）。(F类)用CAPE和CAPE-MotAb治疗A549异种移植物后的肿瘤生长抑制率（平均值±SD，n个= 4), ***第页<0.001（学生t检验）。所有配方均以等效剂量的CAPE（200 mg/Kg/2天）腹腔注射。
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