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.2020年6月8日；11(6):428.
doi:10.1038/s41419-020-2639-1。

NMMHC IIA通过促进脑缺血/再灌注中F-肌动蛋白依赖性ATG9A的运输而触发神经元自噬细胞死亡

王广云 1, 王铁正 1, 杨虎 1, 王杰曼 1, Yan Wang（王燕） 2, 张媛媛 1, 方丽 1, 刘文涛 三, 杨孙 4, 余博阳 5, Junping寇 6
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NMMHC IIA通过促进脑缺血/再灌注中F-肌动蛋白依赖性ATG9A的运输而触发神经元自噬细胞死亡

王广云等。 细胞死亡病. .

摘要

先前的研究表明，非肌肉肌球蛋白重链IIA（NMMHC-IIA）参与了由饥饿引起的黑腹果蝇自噬诱导；然而，其对神经元自噬的功能作用尚不清楚。本研究旨在探讨NMMHC IIA在脑缺血诱导的神经元自噬中的作用以及与自噬相关基因9A（ATG9A）贩运相关的潜在机制。功能测定和分子机制研究用于研究NMMHC IIA在体内外脑缺血诱导的神经元自噬中的作用。采用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，评价肌球蛋白II ATP酶抑制剂布利司他丁的治疗效果。其中，NMMHC IIA的缺失或敲除导致原代培养皮层神经元和暴露于氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）的嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的细胞活力增加。此外，OGD/R上调了NMMHC IIA和自噬标记物LC3B，并且抑制NMMHC II A显著降低了OGD诱导的神经元自噬。此外，NMMHC IIA诱导的自噬是通过与F-actin和ATG9A的相互作用来响应OGD/R。NMMHC II A-actin的相互作用有助于ATG9A的贩运和自噬体的形成。使用blebbistatin和F-actin聚合抑制剂细胞松弛素D抑制NMMHC-IIA-actin相互作用显著抑制ATG9A的运输和自噬诱导。此外，布利司他丁可显著改善小鼠缺血发作后的神经功能缺损和梗死体积，并伴有ATG9A转运和自噬抑制。这些发现证明了NMMHC IIA抑制对脑缺血/再灌注背景下调节ATG9A转运依赖性自噬激活的神经保护作用。

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数字

图1
图1。NMMHC IIA抑制可防止OGD/R诱导的神经元损伤。
一原代皮层神经元用OGD处理6h，并通过蛋白质印迹测定NMMHC IIA在不同复氧时间点的表达。b条用抗NMMHC IIA的siRNAs转染初级皮质神经元，OGD/R处理后用MTT评估细胞活力。c（c）在PC12细胞中使用CRISPR/Cas9系统删除myh9基因。OGD/R处理后，用MTT法检测细胞活力。KO击倒。d日,电子用抗NMMHC IIA的siRNAs转染PC12细胞，并在OGD/R处理后评估细胞活力和细胞形态。NC负控制。（f）用MYH9质粒转染PC12细胞48小时，并在OGD/R处理后描述细胞活力。所有数据均以平均值±SD表示，n个 = 6###P（P） < 0.001与对照组；*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01 vs.OGD/R治疗组。克使用CRISPR/Cas9系统删除MYH9基因，然后用MYH九质粒转染PC12细胞。转染后用MTT法检测细胞活力。小时在MYH9-过度表达细胞OGD/R期间，用自噬抑制剂3-MA（3 mM）治疗。MTT法检测细胞活力。我在myh9基因敲除细胞的OGD/R过程中，用自噬诱导剂雷帕霉素（0.1μM）处理，然后用MTT检测细胞活力。用OGD处理PC12细胞和神经元6 h，然后再复氧6 h。所有数据均以平均值±SD表示，n个 = 6#P（P） < 0.05,##P（P） < 0.01和###P（P） < 0.001.
图2
图2。NMMHC IIA抑制减弱PC12细胞和初级皮质神经元对OGD/R的自噬反应。
一将原代皮层神经元暴露于OGD/R中，通过western blot检测LC3B在不同复氧时间点的表达。b条OGD/R反应神经元中NMMHC IIA表达与LC3B的相关性分析。c（c）,d日用抗NMMHC IIA的siRNAs转染初级皮质神经元，并通过western blotting检测Beclin 1和LC3B的表达。电子,（f）在PC12细胞中使用CRISPR/Cas9系统删除MYH9基因。OGD/R处理后，采用western blot分析检测Beclin 1和LC3B-II的表达。克,小时将MYH9质粒转染PC12细胞48 h，然后通过OGD/R处理评估Beclin和LC3B-II的表达。所有数据均表示为三个独立实验的平均值±SD。#P（P） < 0.05,##P（P） < 0.01，以及###P（P） < 0.001与对照组相比；*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01，以及***P（P） < 0.001 vs.OGD/R治疗组。我,j个PC12细胞感染mRFP-GFP-LC3B腺病毒，然后接受OGD/R。Bar:10µm。WT野生型。k,我NMMHC IIA过表达或缺失后，用Baf处理PC12细胞，并制备细胞裂解物用于分析LC3的表达。用OGD处理PC12细胞和神经元6h，然后再复氧6h。#P（P） < 0.05和##P（P） < 0.01.
图3
图3。NMMHC IIA在PC12细胞OGD/R期间与F-actin和ATG9A相互作用。
一OGD/R处理的PC12细胞用NMMHC IIA（绿色）、F-actin（红色）和DAPI（蓝色）染色。棒：5µm。b条用Pearson系数评估NMMHC IIA与F-actin的显色作用。c（c）OGD/R处理的PC12细胞用NMMHC IIA（绿色）、TGN46（红色）和DAPI（蓝色）染色。棒材：5µm。d日Co-IP用于检测肌动蛋白和NMMHC IIA之间的蛋白质相互作用。WCL，全细胞裂解物。电子,（f）OGD/R处理的PC12细胞用Atg9A（绿色）、NMMHC IIA（红色）和DAPI（蓝色）染色。棒材：5µm。NMMHC IIA与ATG9A的共定位通过Pearson系数进行评估。结果表示为平均值±SD，n个 = 三。###P（P） < 0.001.克Co-IP用于检测ATG9A和NMMHC IIA之间的蛋白质相互作用。
图4
图4。NMMHC IIA在OGD/R后通过其头部和尾部结构域与F-actin和ATG9A相互作用。
一用OGD处理PC12细胞6 h，然后再复氧6 h。用Co-IP检测NMMHC IIA敲除PC12细胞中ATG9A和F-actin之间的蛋白相互作用。b条NMMHC IIA与F-actin和ATG9A相互作用的示意图。c（c）Co-IP用于检测HEK293T细胞中ATG9A与NMMHC IIA不同区域的蛋白相互作用。d日Co-IP用于检测HEK293T细胞中F-actin与NMMHC-IIA不同区域的蛋白相互作用。
图5
图5。抑制NMMHC IIA–肌动蛋白相互作用可缓解PC12细胞OGD/R期间ATG9A的转运和神经元自噬细胞死亡。
用OGD处理PC12细胞6 h，然后再复氧6 h。一共焦显微镜用于检测NMMHC IIA（绿色）、F-actin（红色）和DAPI（蓝色）。棒材：2µm。b条用Pearson系数评估NMMHC IIA与F-actin的显色作用。c（c）Co-IP用于检测肌动蛋白和NMMHC IIA之间的蛋白质相互作用。d日共聚焦显微镜检测ATG9A（绿色）、TGN46（红色）和DAPI（蓝色）。棒材：2µm。电子在NMMHC IIA基因敲除的PC12细胞中，用共焦显微镜检测ATG9A（绿色）、TGN46（红色）和DAPI（蓝色）。棒材：2µm。（f）,克用GFP-LC3B质粒转染PC12细胞，OGD/R处理后检测EGFP-LC3B点。棒：2µm。小时,我Beclin 1和LC3B的表达通过免疫印迹法进行描述。j个OGD/R处理后用MTT法评估细胞活力。结果表示为平均值±SD，n个 = 三。##P（P） < 0.01与对照组比较；**P（P） < 0.01,*P（P） < 0.05 vs.模型组。
图6
图6。抑制NMMHC IIA–肌动蛋白相互作用可缓解初级皮层神经元OGD/R期间ATG9A的转运和神经元自噬细胞死亡。
神经元接受6小时OGD治疗，然后再复氧6小时。一共焦显微镜用于检测NMMHC IIA（绿色）、F-actin（红色）和DAPI（蓝色）。棒材：2µm。b条用Pearson系数评估NMMHC IIA与F-actin的显色作用。c（c）共聚焦显微镜检测ATG9A（绿色）、TGN46（红色）和DAPI（蓝色）。棒：2µm。Ble blebbistatin。d日,电子将GFP-LC3B质粒转染原代皮层神经元，OGD/R处理后检测EGFP-LC3B点。棒材：2µm。（f）,克免疫印迹显示Beclin和LC3B-II的表达。小时OGD/R处理后用MTT法评估细胞活力。结果表示为平均值±SD，n个 = 三。###P（P） < 0.001与对照组；*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01，以及***P（P） < 0.001 vs.OGD/R治疗组。
图7
图7。贝伐他汀减轻脑缺血/再灌注损伤。
一对小鼠进行不同时间点的脑缺血再灌注1h。双重免疫染色显示NMMHC IIA（LC3B）在神经元中的定位。棒材：50µm。b条NMMHC IIA和LC3B阳性神经元的量化。##P（P） < 0.01 vs.假手术组。小鼠接受1h脑缺血再灌注2h。c（c）不同组的神经功能缺损评分。d日H&E染色显示小鼠大脑在MCAO/R.Bar:50µm上的形态学特征。电子代表性的TTC染色脑切片和不同组梗死体积的定量分析。结果表示为平均值±SD，n个 = 6–11.###P（P） < 0.001与假手术组；**P（P） < 0.01和***P（P） < 0.001与。模型组。（f）TUNEL染色显示凋亡神经元对MCAO/R.Bar:50µm的反应。
图8
图8。Blebbistatin可减少脑缺血/再灌注引起的ATG9A转运和神经元自噬。
小鼠接受1h脑缺血再灌注2h。一共聚焦显微镜用于检测NMMHC IIA（蓝色）、F-肌动蛋白（红色）和Neun（绿色）。棒材：50µm。b条Co-IP用于检测MCAO/R上肌动蛋白和NMMHC IIA之间的蛋白质相互作用。C类共聚焦显微镜检测ATG9A（绿色）、TGN46（红色）和DAPI（蓝色）。棒材：20µm。d日,电子Beclin和LC3B-II的表达通过免疫印迹法进行描述。结果表示为平均值±SD，n个 = 三。##P（P） < 0.01和###P（P） < 0.001 vs.假手术组；*P（P） < 0.05,**P（P） < 0.01，以及***P（P） < 0.001与模型组比较。（f）,克然后用共聚焦显微镜检测Beclin 1/LC3B（绿色）和Neun（红色）。棒材：20µm。
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