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.2020年6月；12(6):535-544.
doi:10.1038/s41557-020-0472-x。 Epub 2020年5月29日。

工程化的三重正交吡咯烷基-tRNA合成酶/tRNA对能够对三种不同的非标准氨基酸进行遗传编码

丹尼尔·邓克尔曼 # 1, 朱利安·C·W·威利斯 # 1, 亚当·贝蒂 1, 杰森·W·琴 2
附属公司

工程化的三重正交吡咯烷基-tRNA合成酶/tRNA对能够对三种不同的非标准氨基酸进行遗传编码

丹尼尔·邓克尔曼等。 自然化学. 2020年6月.

摘要

为了扩展和重新编程细胞的遗传代码以纳入多种不同的非规范氨基酸（ncAAs），以及非规范生物聚合物的编码生物合成，需要发现多种正交氨酰转移RNA合成酶/tRNA对。这些对必须与宿主合成酶和tRNA相互正交。吡咯烷酰-tRNA合成酶（PylRS）/派尔tRNA对是最广泛使用的遗传密码扩展系统。这里，我们揭示了ΔNPylRS的序列/ΔNPyltRNA对（缺乏N末端结构域）形成两个不同的类别。我们表明，ΔNPylRS和ΔNPyltRNA与基于序列的聚类相关，大多数ΔNPylRS优先与ΔNPyl来自他们班的tRNA。然后，我们从88ΔNPylRS中识别出18个相互正交的对/ΔNPyltRNA组合测试。此外，我们生成了一组12个三重正交对，每个对由三个新的PylRS组成/派尔tRNA对。最后，我们在一个三重正交集合内，将每对ncAA的特异性和解码特性分开，并将三种不同的非标准氨基酸合并到一个多肽中。

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竞争利益：作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。识别两类ΔNPylRS/ΔNPyltRNA对和18个自然相互正交的ΔNPylRS/ΔNPyltRNA对。
一，的层次聚类ΔNPyl序列相似性得分转换为欧几里德距离度量和完全连锁聚类的tRNA（使用程序确定R工作室). 序列标识分数百分比显示为热图。聚类结果的树状图显示了ΔNPyltRNA分为两个序列相关类。b，所示ΔNPylRS的层次聚类/ΔNPyltRNACUA公司基于GFP荧光的配对（即由此产生的GFP（150TAG）的表达）他的6在BocK在场的情况下1)转换为欧几里德距离度量并完成链接聚类（使用程序确定R工作室). 补充图6提供了显示重复次数的条形图和显示s.d.的误差条形图。所有数值见补充表3。聚类结果的树状图显示了ΔNPyltRNAs和ΔNPylRS分为两个功能相关类。功能。，功能。c（c），热图显示体内琥珀色抑制数据，如中所述b对于18个相互正交的对。d日，示意图表示自然相互正交ΔNPylRS/ΔNPyltRNA对。A类合成酶和tRNAs为蓝色，B类合成素和tRNAs为黄色。黑色箭头表示高活动性，灰色虚线箭头表示对应于功能正交性的最低活动性。
图2
图2。这个嗯PylRS公司/嗯 派尔tRNA对与任何ΔNPyltRNA和一些ΔNPylRS。
一、GFP他的6每个PylRS产生的荧光嗯 派尔tRNACUA公司由GFP（150TAG）产生他的6在BocK在场的情况下1。每个条形代表四个生物复制±标准差的平均值。各个数据点以点表示。所有数值见补充表3。b、GFP他的6荧光由嗯每个PylRS派尔tRNACUA、，amd GFP（150标签）他的6在BocK在场的情况下1每个条形图代表B类三次生物复制的平均值±s.dΔNPyltRNACUA公司s或四个生物复制±s.d.（A类）ΔNPyltRNACUA公司s和嗯 派尔tRNACUA公司。各个数据点显示为点。c（c），A类和B类ΔNPylRS之间的功能相互作用示意图/ΔNPyltRNA对相互关联嗯PylRS公司/嗯 派尔tRNA。黑色箭头表示高活动，灰色箭头表示低活动，灰色虚线箭头表示对应于功能正交性的最小活动。
图3
图3。识别三正交活性类别+N+NPyl（NPyl）tRNA。
一、GFPHis6指示荧光+NPyl（NPyl）tRNACUA公司因解码GFP（150TAG）His中的琥珀密码子而产生6在英国银行在场的情况下1每个热图值代表三个生物复制的平均值。补充图11中提供了包括误差条在内的条形图，并在补充表3中提供了所有数值。的数据Spe公司 派尔tRNA的轮廓为绿色。b，三叶草叶结构嗯 派尔tRNA和Spe公司 派尔tRNA。突出显示的C-U点突变将Watson-Crick碱基对更改为摆动碱基对Spe公司 派尔tRNA与测试的每个ΔNPylRS正交。c（c），生成三正交PylRS的进展示意图/派尔替换时的tRNA对嗯 派尔tRNA（左）用于Spe公司 派尔tRNA（右）。黑色箭头表示高活性，灰色箭头表示低活性，灰色虚线箭头表示对应于函数正交性的最小活性。The interactions of the+NPyl（NPyl）在所示实验中操纵的tRNA一突出显示。
图4
图4。识别三正交活性A类ΔNPyltRNA。
一，三叶草叶结构阿尔夫 ΔNPyltRNACUA公司具有可变循环扩展和点突变的变体以蓝色突出显示。b、GFP他的6野生型荧光阿尔夫 ΔNPyltRNACUA公司或指示的阿尔夫 ΔNPyltRNACUA公司含有GFP（150TAG）的细胞中每个PylRS的变体他的6在BocK在场的情况下1每个热图值代表三个生物复制的平均值。补充图13提供了条形图，包括显示s.d.的误差条，补充表3提供了所有数值。阿尔夫 ΔNPyltRNA（8）CUA公司,阿尔夫 ΔNPyltRNA（11）CUA公司和阿尔夫 ΔNPyltRNA（19）CUA公司所有这些都显示出改进的正交性嗯PylRS和B类ΔNPylRS，同时与A类ΔnpylRS保持激活状态（用绿色框突出显示）。c（c），生成三正交PylRS的进展示意图/派尔替换野生型时的tRNA对阿尔夫 ΔNPyltRNA（左）选中阿尔夫 ΔNPyltRNA变体（右）。黑色箭头表示高活性，灰色箭头表示低活性，灰色虚线箭头表示对应于函数正交性的最小活性。的相互作用阿尔夫 ΔNPyl重点介绍了在这些实验中操纵的tRNA。
图5
图5。识别三正交活性B类ΔNPyltRNA。
一，B类进化示意图国际 ΔNPyltRNA。三叶草叶片结构国际 ΔNPyltRNACUA公司库中显示的随机核苷酸以浅黄色（可变环库）或深黄色（受体干库）突出显示。国际 ΔNPyltRNACUA公司混合源于组合每个库中的最佳点击数。b，GFP荧光（150TAG）他的6在含有BocK的细胞中1和国际 ΔNPyltRNACUA公司每个热图值代表三个生物复制品的平均值。补充图17中提供了包括显示s.d.的误差条的条形图，补充表3中提供了所有数值。c（c），生成三正交PylRS的进展示意图/派尔替换野生型时的tRNA对国际 ΔNPyltRNA（顶部）国际 ΔNPyltRNA杂交（底部）。黑色箭头表示高活动，灰色箭头表示低活动，灰色虚线箭头表示对应于功能正交性的最小活动。The interactions of国际 ΔNPyl重点介绍了在这些实验中操纵的tRNA。d日，所有三正交PylRS集的热图表示/派尔本研究中产生的tRNA对。每个热图值代表三次生物复制的平均值。补充图17和18中提供了条形图，包括显示s.d.的误差条。每个三元组由嗯PylRS和Spe公司 派尔tRNA、一种特殊的a类ΔNPylRS和一种进化的阿尔夫 ΔNPyltRNA变异体、一种特殊的B类ΔNPylRS和一种进化的国际 ΔNPyltRNA杂交。
图6
图6。通过对三重正交PylRS/tRNA对的不同氨基酸识别和解码，可以将三种不同的ncAA并入蛋白质中。
一，每个三重正交PylRS或活性位点突变，（百万PylRS，亮度1PylRS（NmH）和1R26号机组PylRS（Cbz）导致从GFP（150TAG）His合成GFP6存在同源ncAA（2mM），但不存在其他三重正交PylRS的同源ncAA。每个条代表三个生物复制±标准差的平均值。各个数据点显示为点。所有数值见补充表3。b-d（英国）在所有三个ncAA存在的情况下，每个PylRS或活性位点变体选择性地结合其同源ncAA以响应琥珀色终止密码子。从GFP（150TAG）表达的镍-NTA纯化GFP的TOF-MS他的6在8 mM BocK在场的情况下1，8毫微米每小时2和2 mM CbzK三.（GFP（150万桶）他的6预测质量27941，发现质量27942；GFP（150牛顿米）他的6预测质量27864，发现质量27863.5；GFP（150CbzK）他的6预测质量：27975，发现质量：27995）e、，识别不同ncAA以解码不同密码子的三重正交对衍生物的发散。GSTCAM纯化自大肠杆菌含有核糖-Q1、O-GST-CAM（1XXX）（XXX代表TAG、AGGA或AGTA）和三种指定的PylRS/tRNA衍生物。BocK和NmH的浓度为8mM，而CbzK的浓度为2mM。样品通过SDS-PAGE进行分析。本实验在3个生物重复中进行，结果相似。全凝胶和生物三倍体如补充图19所示。（f），将三个ncAA掺入到单个多肽中。Ni NTA纯化后的抗Strep蛋白质印迹链球菌GFPHis公司6包含O-strepGFP（XX）His的所有三个ncAA6，其中XX代表wt或三重突变体：40TAG、136AGGA和150AGTA。大肠杆菌也含有核糖-Q1，嗯PylRS公司/Spe公司PyltRNACUA公司,亮度1活塞（NmH）/国际 派尔tRNA(一17,V（V）C10）加州大学联合会和1R26号机组PylRS（CbzK）/阿尔夫 派尔tRNA（8）UACU。ncAAs的使用浓度如下：8 mM BocK、8 mM NmH、2 mM CbzK）。本实验在三个生物重复中进行，结果相似。全杂交和生物三倍体如补充图20所示，GFP荧光测量如补充图21所示。克纯化的TOF-MS链球菌GFPHis公司6从含有O-strepGFP（40TAG，136AGGA，150AGTA）的细胞中纯化6，O-核糖-Q1，嗯PylRS公司/Spe公司PyltRNACUA公司,亮度1PylRS（NMH）/国际 派尔tRNA(一17,V（V）C10）加州大学联合会和1R26号机组PylRS（CbzK）/阿尔夫 派尔tRNA（8）UACU（通用汽车控制单元）存在8 mM BocK、8 mM NmH和2 mM CbzK。(斯特雷普GFP（40BocK，136NmH，150Cbz）他的6预测质量：29314.5，发现质量：29321）。小时示意图显示了为产生活性对而产生的九种特异性功能（三种特异性ncAA识别、三种特异性aaRS/tRNA识别和三种特异性密码子-反密码子相互作用）（黑色箭头）。该示意图还显示了已经消除的18个潜在相互作用（灰色虚线箭头），以确保三对之间的正交性。内源性氨基酸、合成酶和tRNA与工程化三重正交对之间的大量潜在相互作用已被消除，以确保正交性。mRNA，信使RNA。
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中的注释

  • 提高核糖体储备。
    Reinkemeier CD，Lemke EA。 Reinkemeier CD等人。 自然化学。2020年6月；12(6):503-504. doi:10.1038/s41557-020-0476-6。 自然化学。2020 PMID：32472100 没有可用的摘要。

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