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.2020年5月5日5:9:e53165。
doi:10.7554/eLife.53165。

角蛋白14依赖性二硫化物通过14-3-3σ和YAP1调节表皮稳态和屏障功能

郭亚娟 1 2, 凯瑟琳·雷德蒙德 2, Krystynne A Leacock公司 1, 玛格丽塔五世·布罗夫基纳 三, 苏云记 2, 维诺德·贾斯库拉·朗加 4, 皮埃尔·A·库仑 1 2 5 6
附属公司

角蛋白14依赖性二硫化物通过14-3-3σ和YAP1调节表皮稳态和屏障功能

郭亚娟等。 埃利夫. .

摘要

中间丝蛋白角蛋白14（K14）为表皮基底角朊细胞提供重要的结构支持。最近的研究证明，K14依赖性二硫键在皮肤角质形成细胞中角蛋白IF的组织和动力学中发挥作用。在这里我们报道了敲入小鼠在Krt14号机组’s密码子373（C373A）在二硫键结合的K14物种中表现出改变，并表现出继发于表皮增殖增强、转运时间加快和分化改变的屏障缺陷。蛋白质组学筛选确定14-3-3为K14相互作用蛋白。后续研究表明，皮肤角质形成细胞中由14-3-3sigma调节的Hippo信号的转录效应器YAP1显示出异常的亚细胞分配和分化功能Krt14号机组C373A角质形成细胞。K14中的C373残基是角蛋白的一个亚类，在早期分化的角蛋白细胞中是一种新的角蛋白组织和YAP功能的调节因子，对表皮的细胞力学、内稳态和屏障功能有影响。

关键词：14-3-3; 细胞生物学；表皮；河马；中间丝；角质形成细胞；小鼠；皮肤。

PubMed免责声明

利益冲突声明

YG、CR、KL、MB、SJ、VJ、PC未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.K14依赖性二硫键物种减少和表皮增厚Krt14号机组C373A小鼠皮肤。
(A类)半胱氨酸（C）残基在小鼠K14蛋白（C4、C18、C36、C58、C373、C395）中的位置，其中N端头部和C端尾部结构域位于中央α-螺旋杆结构域的侧面（由连接子L1和L12分隔的线圈1A、1B和2（蓝框））。(B类)小鼠K14和其他小鼠I型角蛋白中的序列上下文侧翼残基C373的比对（顶部）以及其他物种中的K14的比对（底部）。七分位重复出现在底部。”xxxx’标记口吃序列的位置（绿色字母）。(C类)用于生成的策略示意图Krt14号机组使用Crispr/Cas9系统的C373A小鼠。sgRNA，单导向RNA；PAM，原间隔区邻接基序。(D类)Sanger测序显示TGC到GCA在第373密码子（半胱氨酸到丙氨酸）的颠倒Krt14号机组基因。(电子)年轻成年人Krt14号机组C373A WT同窝雄性小鼠的体重相似。每个基因型的N=7。(F类)来自WT和WT的耳朵、爪子、背部皮肤和尾部皮肤的总蛋白裂解物的免疫印迹分析Krt14号机组C373A年轻成年小鼠在还原（+TCEP）和非还原（-TCEP）条件下进行SDS-PAGE电泳。(G公司)单体上K14-依赖二硫化物相对量的量化（见c）。N=3个重复。数据表示平均值±SEM。学生t检验：无统计学差异*p<0.05***p<0.005。
图2。
图2.中形态和屏障状态的变化Krt14号机组C373A皮肤。
(A类)甲苯胺蓝染色切片（1 mm厚，取自年轻成年WT和Krt14号机组C373A小鼠。(B类)WT和WT耳朵（左）和尾巴（右）皮肤的整个表皮厚度（活表皮层和角质层）的量化Krt14号机组C373A小鼠。对每个基因型的3只小鼠中的每只进行五个随机区域的取样。比例尺，20µm。(C类)WT和Krt14号机组基线时（未经处理）和丙酮诱导屏障破坏后的C373A耳部皮肤。N=每个样品6个。D.WT和Krt14号机组基线C373A皮肤。N=3个生物复制。(电子)丙酮处理后DAMP mRNA水平的相对折叠变化（qRT-PCR）。N=3个生物复制。(F类)从WT和Krt14号机组C373A尾皮。(G公司)定量d内角化包膜的表面积、周长和长宽比。四只小鼠中的每只小鼠计数约100个CE。数据表示平均值±SEM。学生t检验：*p<0.05**p<0.01***p<0.005；无统计差异。比例尺，100µm。
图2——图补充1。
图2-补充图1：耳部皮肤纯化角质膜的分析。
(A类)从WT和Krt14号机组C373A耳部皮肤。棒材，100µm。(B类)CEs表面积、周长和长宽比的定量。N＝4。每只老鼠大约测量100个CE。数据代表平均值±SEM。学生t检验：*p<0.05，无统计学差异。
图3。
图3组织内稳态改变和角质形成细胞分化失调Krt14号机组C373A皮肤。
(A类)WT和WT尾部皮肤切片中Edu的间接免疫荧光Krt14号机组用胸苷类似物EdU治疗后2小时、1天和3天时的C373A。细胞核用DAPI染色（蓝色）。(B类)每毫米表皮基底层和基底上层EdU阳性细胞核数量的量化。N=每个样品重复3次。(C类)年轻成年WT和WT尾表皮的TUNEL染色Krt14号机组C373A小鼠。D.框c中显示的TUNEL阳性细胞的定量。N=每个样品4只小鼠。E.从WT和Krt14号机组C373A尾皮。虚线表示皮肤-表皮界面。(F类)量化每毫米表皮中p63阳性细胞核的数量（左）及其与基底层的距离（右）。N=每个样品重复3次。(G公司)WT和WT尾部皮肤切片中K14（绿色）、K10（红色）、filagrgin和loricrin的间接免疫荧光Krt14号机组C373A小鼠。(H（H）)量化框架g中显示的数据的相对荧光强度，标准化为WT.N=3只小鼠/样品。(我)WT和WT尾部皮肤切片中claudin 3、E-cadherin和desmoplakin的间接免疫荧光Krt14号机组C373A小鼠。(J型)相对荧光强度的定量，g.N=3只小鼠/样品。在a、c、e、g和I中，细胞核用DAPI染色（蓝色），虚线表示真皮-表皮界面。比例尺，20µm。b、d、f、h和g中的数据表示平均值±SEM。学生t检验：*p<0.05**p<0.01***p<0.005；不另作说明，无差异。
图3——图补充1。
图3-图补充1。小鼠背部皮肤组织的末端分化分析。
(A至C)年轻成人WT背部皮肤组织的冷冻切片Krt14号机组使用抗体对C373A进行双重间接免疫荧光(A类)K14和K10；(B类)K14和丝聚蛋白；和(C类)K14和洛里克林(D类)与A相同，只是使用了针对Yap1的抗体。与尾巴和耳朵皮肤组织的情况不同（见图2和图3），Krt14号机组C373A表皮厚度正常，分化标志物分布正常。与文献一致（Beverdam等人，2013），YAP1染色大大减少，且不局限于背部皮肤表皮的基底层。细胞核用DAPI（蓝色）染色，虚线表示真皮-表皮界面。表皮；真皮，真皮。比例尺，20µm。
图3——图补充2。
图3-图补充2：超微结构变化和异常细胞核Krt14号机组C373A角质形成细胞。
(A类)WT和Krt14号机组C373A小鼠。(B类)框架a中代表性细胞的高倍图像。虚线标记真皮-表皮界面。星号表示突变中角蛋白丝（kf）和细胞核（Nu）之间存在异常间隙的区域Krt14号机组C373A角质形成细胞。箭头表示细胞核内陷的细胞质Krt14号机组C373A角质形成细胞。比例尺，5µm。(C类)核内陷频率的量化（每个基因型有两个生物复制品，n=14个核）。数据表示平均值±SEM。学生t检验：***p<0.005。
图4。
图4..14-3-3σ与K14相互作用，异常定位14-3-3σ和YAPKrt14号机组C373A表皮。
(A类)WT新生皮肤角质形成细胞（原代培养，1 mM钙，4天）中与K14相互作用的蛋白质质谱筛查中最丰富的九个非角蛋白条目。谱计数和已知的河马信号相关性被指出。完整列表参见图4补充图1。(B类)来自WT的K14免疫沉淀或Krt14号机组C373A原代培养的皮肤角质形成细胞。K14 WT和373A突变体都与HA标记的14-3-3σ相互作用，尽管程度较小。KDa，千道尔顿。(C类)WT中14-3-3σ的间接免疫荧光Krt14号机组C373A尾部蒙皮部分。虚线表示皮肤-表皮界面。(D类)WT中YAP的间接免疫荧光和Krt14号机组C373A尾部蒙皮部分。(电子)YAP靶基因的相对mRNA水平（qRT-PCR）通讯录1,Zeb1号机组,通讯录2、和蜗牛2成年WT和Krt14号机组C373A尾皮。N=每个基因型3个生物复制。(F类)总YAP和YAP的免疫印迹分析序列127WT和Krt14号机组C373A尾皮蛋白裂解物。(G公司)框架d中显示的相对蛋白质水平的量化。数据为三个生物复制的平均值±SEM。学生t检验：*p<0.05**p<0.01***p<0.005；无统计差异。比例尺，20µm。
图4——图补充1。
图4补充图1。原代培养中新生皮肤角质形成细胞的附加分析。
(A类)添加钙后，在无钙（0小时）和有钙（15小时和4天）的情况下，对原代培养的WT新生角质形成细胞的总蛋白提取物进行Western blot分析。如左图所示，运行凝胶是指没有或存在TCEP降低。该分析显示了添加钙后K14依赖的二硫化物物种的形成动力学。Involucrin是角质形成细胞终末分化的标志物；actin用作加载控件。(B类)框架A中所示凝胶数据的量化（凝胶扫描密度测定）。数据表示N=3个生物复制品的平均值±SEM。(C类)Western blot分析比较了向WT和Krt14号机组原代培养中的C373A新生角质形成细胞。Filaggrin表现为一系列离散尺寸产品，与其模块化重复子结构相一致。(D类)框架C中所示凝胶数据的量化（凝胶扫描密度测定）。数据表示N=3个生物复制品的平均值±SEM。(电子)WT中14-3-3σ和YAP1的邻近连接分析（PLA）Krt14号机组初级培养的C373A新生角质形成细胞接受1 mM钙诱导分化4天。巴=20µm。细胞核用DAPI染色（蓝色）。(F类)框架E中所示数据的量化。我们为每个基因型计算了42个细胞。数据表示平均值±SEM。学生t检验：***p<0.005；不另作说明，无差异。
图5。
图5.14-3-3σ和YAP活性在Krt14号机组C373A角质形成细胞。
(A类)WT和WT中YAP（红色）和K14（绿色）的间接免疫荧光显微镜Krt14号机组C373A新生皮肤角质形成细胞在缺乏和存在1 mM钙的原代培养中（持续4天）。箭头表示原子核的位置。(B类)在框架a中用核YAP定量细胞。N=3个生物复制品。在每种情况下，每个基因型大约有100个细胞。N=3个生物复制。数据表示平均值±SEM。学生t检验：无统计学差异***p<0.005。比例尺，20µm。(C类)转染荧光素酶基因的HeLa细胞的荧光素素酶检测通讯录1-荧光素酶报告子构建（参见材料和方法）。根据转染效率和pRL-TK载体控制获得的信号对数据进行标准化。数据表示三个生物重复的平均值±SEM，每个重复包含6个技术重复。使用GraphPad Prism 8进行Mann-Whitney测试以比较每个参数**p<0.01，*p<0.05，无显著性差异。
图5——图补充1。
图5-图补充1。YAP的定位受人类K14中半胱氨酸残基367的特异性调节。
新生儿皮肤角质形成细胞Krt14号机组在原代培养中接种空白小鼠，瞬时转染GFP-K14 WT、GFP-K14CF、GFP-K14C367A或GFP-K114CF-C367构建物，并在分析前在1 mM钙中培养36小时。(A类)间接免疫荧光显示成功转染的活细胞（见星号）。比例尺，20µm。(B类)用核YAP染色定量GFP-K14转染细胞的百分比。N=3个生物复制。对每个基因型和每个结构体的N=100个细胞进行计数。数据代表平均值±SEM。学生t检验：***p<0.005；没有区别。(C类)无质粒瞬时共转染HeLa细胞中角蛋白丝的组织（左）、mCherry-K5（WT）和pEGFP-K14（WT。细胞核用DAPI染色。比例尺，20µm。
图6。
图6.中的更改机制Krt14号机组培养的C373A表皮和角质形成细胞。
(A-C公司)研究涉及年轻成年WT和Krt14号机组C373A小鼠。A.间接免疫荧光显微镜检查α-连环蛋白、桥粒蛋白1和层粘连蛋白A/C。虚线表示皮肤-表皮界面。B.WT和Krt14号机组C373A。N=3个生物复制。(C类)WT和WT尾部皮肤切片α-catenin中a-18机械敏感性表位的间接免疫荧光显微镜观察Krt14号机组C373A小鼠（见A）。D-F：在原代培养中研究新生皮肤角质形成细胞。(D类)WT和Krt14号机组按照框架a、c所述培养的C373A角质形成细胞N=3个生物复制品（每个基因型每次计数的细胞总数为100个）。(电子)WT和WT原代培养中层粘连A/C（顶行和中行）和α-连环蛋白（底行）的间接免疫荧光显微镜检查Krt14号机组C373A新生角质形成细胞。(F类)与E相同，只是F-actin（通过指骨肽）和Ser19-磷酸化肌球蛋白轻链pMLC（Ser19）被染色。在框架A、C、E和F中用DAPI对细胞核进行染色。标尺为20µm。B和F中的数据表示平均值±SEM。学生t检验：*p<0.05***p<0.005；无统计差异。
图7。
图7：描述角质形成细胞启动表皮终末分化时，角质形成依赖性二硫键在整合信号和机械线索中的作用的模型。
(A类)从左至右：表皮分化阶段、角蛋白表达、表皮形态和角蛋白丝组织状态与14-3-3结合、YAP1亚细胞分配和Hippo活性状态有关。该模型提出，基底层晚期前体角质形成细胞终末分化的启动需要：（1）通过coil 2结构域中保守的stutter半胱氨酸形成K14依赖性二硫化物；（2） 细胞核周围角蛋白丝的重组；（3） 角蛋白丝上14-3-3的募集；和（4）YAP1在细胞质中的有效螯合，导致Hippo信号传导的激活。该模型提出了角蛋白10线圈2中保守半胱氨酸的相同作用，该半胱氨酸在末端分化早期表达，从而维持YAP1对细胞质的隔离和活性Hippo信号。随着基底角质形成细胞分层并从基底层向基底层上表皮室移动，这些变化与张力相关力和细胞间黏附复合体的重新分布相耦合（Miroshnikova等人，2018；Nekrasova等人，2018年；Wickström和Niessen，2018年）。(B类)负反馈回路的图示，一旦以特定方式（磷酸化和二硫键）修饰，K14蛋白将隔离YAP1并中断其促进角质形成细胞增殖的活性，从而启动末端分化（相关数据参见图7图补充1和图2）。
图7——图补充1。
图7补充了1。基因组背景、基因表达、染色质组织和感兴趣基因位点中TEAD结合位点的存在。
该信息来自ENCODE项目(www.encodeproject.org)并适用于在有钙或无钙条件下培养的人类前皮肤角质形成细胞（有关详细信息，请参见材料和方法）。四个基因的代表性数据(14韩元,15韩元,ITGB1标准和10韩元)如图所示。细胞接受钙处理0、3和6天。染色质结构（如开放性、封闭性）在基线时通过DNA水解酶处理（钙处理0天）或钙处理后0、3和6天通过ATAC-SEQ进行评估。钙处理后0、3和6天，通过RNA-seq测定转录水平。峰值缩放在第0天、第3天和第6天是相同的，但在基因之间是优化的。基因图以蓝色显示。TEAD共识结合位点的位置由短竖线表示，并以黄色突出显示。近端启动子区域用方框括起来（虚线），转录方向用箭头表示。
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