Knocking Out SST Gene of BGC823 Gastric Cancer Cell by CRISPR/Cas9 Enhances Migration, Invasion and Expression of SEMA5A and KLF2

doi:10.2147/CMAR.S236374

.2020年2月20日12:1313-1321。

doi:10.2147/CMAR。S236374。 eCollection 2020。

淘汰赛不锈钢CRISPR/Cas9表达的BGC823胃癌细胞基因增强SEMA5A和KLF2的迁移、侵袭和表达

魏晨¹, 瑞贤鼎¹, 金鹿堂¹, 李浩东², 陈崇华², 亚鲁·张¹, 张钦贤¹, 朱晓燕¹

附属公司

PMID： 32110105
预防性维修识别码： PMC7040191号
内政部： 10.2147/CMAR。S236374美元

淘汰赛不锈钢CRISPR/Cas9表达的BGC823胃癌细胞基因增强SEMA5A和KLF2的迁移、侵袭和表达

魏晨等。癌症管理研究. 2020.

.2020年2月20日12:1313-1321。

doi:10.2147/CMAR。第36374条。 eCollection 2020。

作者

魏晨¹, 瑞贤鼎¹, 金鹿堂¹, 李浩东², 陈崇华², 张亚茹¹, 张钦贤¹, 朱晓燕¹

附属公司

¹郑州大学基础医学院组织胚胎学系，河南省。
²郑州大学基础医学院临床医学系，河南，中华人民共和国。

PMID： 32110105
预防性维修识别码：项目管理委员会7040191
内政部： 10.2147/CMAR。S236374美元

摘要

背景：SST在GC发生发展中的影响和潜在分子机制尚未确定。

材料和方法：根据SST基因的靶向序列设计了两对sgRNA和报告子进行双缺口检测。将质粒转染到293T中以选择具有更高切割效率的sgRNA。敲除的子行不锈钢基因经FACS筛选，测序和表达水平验证。此外，敲除SST后，通过伤口愈合和穿孔评估其迁移和侵袭能力。此外，通过Western blotting和LSCM观察SEMA5A和KLF2的蛋白表达。最后，我们用Western blotting检测了GC组织中SST、SEMA5A和KLF2的表达水平。

结果：结果表明，新的亚系1E9不锈钢基因，由CRISPR/Cas9建立。此外，GC细胞中SST的敲除显著增加了迁移和侵袭能力。结果还表明，SST基因敲除增加了SEMA5A和KLF2的表达。GC组织中SST的表达水平降低，其降低与SEMA5A和KLF2的过度表达有关。

结论：SST对GC细胞BGC823的迁移和侵袭具有抑制作用。在缺乏SST表达的GC细胞和组织中，SEMA5A和KLF2的蛋白表达水平增强。

关键词：CRISPR/Cas9；胃癌；入侵；迁移；生长抑素。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者报告说，在这项工作中没有利益冲突。

数字

图1
质粒的构建和合适sgRNA的筛选(A类)pmCherry-EGFP-reporter示意图。(B类)用酶消化载体px330 SST sgRNA后进行电泳。在第6行中，大约8500 bp处出现一条带。第1、2、3、4、5和7行出现了三条带。结果表明，重组载体呈圆形，构建成功。(C类)载体pmCherry-EGFP-SST报告子经限制性内切酶消化后进行电泳。在第3行中，约5400 bp处出现一条带，第1行和第2行出现三条带。结果表明，重组载体呈圆形，构建成功。(D类)将载体pmCherry EGFP-SST-reporter和px330-SST-sgRNA共转染293T细胞。如荧光显微镜和流动分析所示，绿色荧光表达的细胞数量代表sgRNA的功效。

图2
细胞敲除的建立*不锈钢*基因。(A类)单克隆细胞群已经形成。(B类)PCR后的电泳性能，结果表明PCR产物呈现不同的条带。在直线6中，BGC823细胞的产物在330 bp处显示为单一带。在第9行中，1E9亚系的产物显示为240 bp的单带。(C类)对1E9的PCR产物进行测序。红色部分与BGC823具有相同的碱基，蓝色部分表示与BGC82 3细胞相比碱基的缺失。(D类)免疫荧光法检测BGC823和1E9中SST蛋白水平。(E类)Western blotting检测BGC823和1E9中SST的蛋白水平。

图3
1E9的迁移和入侵能力高于BGC823。(A类)细胞被电镀并受伤。在0、24和48小时后拍摄照片(****P（P）*<0.001根据双尾t吨测试，比例尺100μm）。(B类)在三个随机字段中计算入侵细胞的数量。显示了侵袭细胞的典型图像(****P（P）*<0.001根据双尾t吨测试，比例尺40μm）。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。

图4
SST的表达与SEMA5A和KLF2呈负相关。(A类)在BGC823和1E9中通过免疫荧光检测SEMA5A和KLF2TEC的蛋白质水平。(B类)通过Western blotting检测BGC823和1E9中SEMA5A和KLF2的蛋白水平。(C类)Western blotting检测5对GC和正常组织中SST、SEMA5A和KLF2的蛋白水平。

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