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.2020年2月26日；11(1):1073.
doi:10.1038/s41467-019-14063-8。

活性乙酰胆碱受体可防止骨骼肌萎缩，有利于神经再生

布鲁诺A西斯特纳 1 2 三, 阿尼巴尔·巴尔加斯 4, 卡洛斯·普埃布拉 4, 保拉·费尔南德斯 5, 罗莎尔巴·埃斯卡米拉 6 5, 卡洛斯·拉各斯 7, 玛丽亚·马图斯 8 9, 克里斯蒂安·维洛斯 10 11, 路易斯·阿塞亚 12, 埃斯特班·巴尔纳菲 13, 雨果·盖特 13, 丹尼尔·埃斯科瓦尔 14, 克里斯托弗·卡多佐 15 16, 胡安·塞兹 17 18
附属机构

活性乙酰胆碱受体可防止骨骼肌萎缩并有利于神经再支配

布鲁诺A西斯特纳等。 国家公社. .

摘要

骨骼肌失神经会导致严重的肌肉萎缩，之前会发生细胞改变，如质膜通透性增加、静息膜电位降低和蛋白质分解代谢加快。导致这些变化的因素仍然未知。相反，失神经后的功能恢复依赖于成功的神经再支配。在这里，我们表明通过运动神经元乙酰胆碱（ACh）的量子释放激活烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）足以防止失神经引起的变化。利用体外实验，ACh和非水解ACh类似物抑制了促进肌肉萎缩的连接蛋白43和连接蛋白45半通道的表达。在共培养研究中，connexin43/45半通道敲除或敲除增加了背根神经节神经元对肌肉纤维的神经支配。我们的结果表明，运动神经元释放的ACh发挥了迄今为止未知的独立于肌纤维收缩的功能。nAChRs和连接蛋白半通道是治疗各种病理条件下突触神经肌肉传递减少的潜在分子靶点。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。培养纤维表达萎缩和自噬基因，但不表达凋亡基因。
在Cx43中进行单侧坐骨神经横断飞行/飞行Cx45型飞行/飞行小鼠（对照小鼠）；在失神经后第7天，收集神经支配（Inne）和失神经支配（Den）的趾短屈肌，通过qPCR（在体）测定特异性mRNA的相对水平。在平行实验中，对照小鼠的肌纤维在对照条件下培养0、48和72小时，或用200 nM卡巴胆碱（Cbc）或100 nM紫杉醇处理，以通过qPCR测定特异性mRNA的相对水平，并通过免疫荧光测定蛋白质（体外）。一Fbxo32（atogin-1）、Trim63（MuRF1）和Bnip3的mRNA相对水平归一化为肌动蛋白β的表达。b条使用共焦显微镜通过免疫荧光法评估阿特拉津-1（绿色）和µ-钙蛋白酶（红色）的相对水平。校准棒：50µm。c（c）Bak1（促凋亡基因）和Bcl2（抗凋亡基因）的mRNA相对水平归一化为肌动蛋白β的表达。d日Bak1/Bcl2的比率。e（电子）通过免疫荧光（DAPI将细胞核染成蓝色）评估anexin V或caspase 3（绿色）的相对水平。校准棒：50µm。棒误差为平均值±SEM。N个 = 4个独立实验。
图2
图2。乙酰胆碱类似物可防止培养肌纤维的细胞改变。采用趾短屈肌（FDB）肌纤维的原代培养。
一在乙炔（Etd）的延时实验中测量了肌膜的通透性+)在培养0、24、48和72h后进行摄取。肌纤维在对照条件下培养（白色），或用500µM ATP（蓝色）或50 ng/mL+NGF/50 ng/mL BDNF（NGF+BDNF；黄色）或200nM Cbc（红色）。b条伊特德+肌纤维摄取率。N个 = 4个独立实验；每个实验记录6条肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001与培养0h的肌纤维相比；通过ANOVA和Bonferroni事后检验，无显著差异。c（c）在培养0、24、48和72小时时评估静息膜电位（RMP）。肌纤维在对照条件下培养，或用ATP、NGF/BDNF或Cbc处理。N个 = 5个独立实验，每个独立实验中至少记录20个肌纤维*第页 < 0.05，通过ANOVA和Bonferroni事后检验与培养0h的肌纤维进行比较。d日上面板，细胞内钙2+信号（340/380），下面板，细胞内钠+分别在培养0和48小时用FURA-2或SBFI记录信号。面板右侧的彩色刻度表示当染料与Ca结合时，颜色从蓝色变为绿色2+或Na+在0时用200 nM卡巴胆碱（Cbc）处理平行培养物，48小时后用Ca2+和Na+对信号进行了评估.在时间0时用200 nM卡巴胆碱（Cbc）处理平行培养物，48小时后用Ca2+和Na+信号已评估.比例尺：50µm。
图3
图3。乙酰胆碱类似物可防止体外细胞的改变，延长其半衰期可防止体内肌纤维尺寸的减小。
Cx43坐骨神经单侧失神经飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：Myo-Core（Cx43飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：MC）小鼠。一体内乙酰胆碱酯酶阻断剂的实验设计。Den：去神经支配，Pyiri：吡西妥明，Eu：安乐死。b条苏木精：去神经后第7天FDB的伊红染色横截面。客栈：无人值守。Den：失去保护。c（c）横截面积（CSA）。N个 = 5; 每个值均为平均值±SEM*第页 < Den的0.05与Student’s的Inne肌肉吨测试。d日拟议模型。去神经支配（Den）消除ACh的保护作用，导致乙酰胆碱（ACh）释放减少，导致钙增加2+和Na+通过从头开始的内流表达非选择性膜通道，增加这些离子的细胞质浓度。因此，RMP从−75 mV降至−55 mV的部分原因是K+流出和钙2+和Na+流入；细胞内钙的增加2+信号促进蛋白质降解。
图4
图4。烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）的活性可防止骨骼肌纤维萎缩。
采用趾短屈肌（FDB）肌纤维原代培养。一在评估乙锭（Etd）的延时实验中测量膜渗透性+)培养24h后进行摄取。肌纤维在对照条件下培养（白色），或用15µM潘库溴铵（Pcu；绿色）处理。b条 N个 = 4; 在每个独立实验中记录的6个肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001，与学生对照组相比，Pcu的影响吨测试。c（c）在培养24小时时评估静息膜电位（RMP）。在对照条件下或用15µM Pcu处理后培养肌纤维。N个 = 5; 每个独立实验中至少记录20条肌纤维*第页 < 0.05，与学生对照组相比，Pcu的效果吨测试。d日上图，细胞内钙2+信号（340/380）和，下部图像，Na+分别用FURA-2和SBFI在培养24小时记录信号。面板右侧的彩色标尺描绘了染料与钙结合时，颜色从蓝色变为绿色2+或Na+用15µM Pcu处理平行培养物，24天后用Ca处理2+和Na+对信号进行评估。比例尺：50µm。e（电子）建议的模型。
图5
图5。乙酰胆碱类似物抑制连接蛋白半通道的表达，导致失神经骨骼肌萎缩。
Cx43趾短屈肌肌纤维的原代培养飞行/飞行Cx45型飞行/飞行和Cx43飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：Myo-Core（Cx43飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：MC）小鼠。一用乙炔（Etd）评估膜的渗透性+)培养0h（左）或48h（右）的摄取实验。前10分钟为基线，之后用200μM La处理肌纤维3+Cx43肌纤维的肌膜通透性飞行/飞行Cx45型飞行/飞行在对照条件下（蓝色圆圈），或在50 ng/mL NGF+50 ng/mL BDNF（NGF/BDNF；红色圆圈）、500µM ATP（灰色圆圈）或200 nM Cbc（黄色圆圈）的培养液中测量。Cx43肌纤维飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：MC小鼠在对照条件下培养（黑圈）。b条伊特德+肌纤维的摄取率。N个 = 4; 每个独立实验中记录五个肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001，以及**第页 < 通过ANOVA和Bonferroni事后测试，将0.005与培养0小时时的肌纤维进行比较。从Cx43获得的数据飞行/飞行Cx45型飞行/飞行小鼠用白色条表示，来自Cx43飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：黑条MC小鼠。c（c）培养0、24和48小时后，使用共焦显微镜通过免疫荧光评估Cx43和Cx45的相对水平。培养48小时的肌纤维也在时间0时用200 nM Cbc处理。校准棒：100µm。d日，等+培养48h时摄取。肌纤维用Cx43+Cx45吗啉酸（Cx43+Cx45 Mor）或Cx43+/Cx45 morpolinos和Lipofectamine®2000处理[（Cx43+Cx45-Mor（Lipo）]。前10分钟为基线，然后用200μM La处理肌纤维3+.e（电子）Etd公司+肌纤维摄取率。N个 = 4; 每个独立实验中记录五个肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001，对于La的影响3+与Cx43+Cx45 Mor相比。无显著差异，对于La3+在Cx43+Cx45 Mor（Lipo）上，通过ANOVA和Bonferroni事后检验，比较Cx43+Cx45 Mor（Libo）。（f）用免疫荧光法评估经Cx43+Cx45 Mor（Lipo）处理48小时后肌纤维中Cx43和Cx45（红色）的相对水平。DAPI（蓝色）。校准棒：50µm。
图6
图6。培养骨骼肌纤维中Cx43和Cx45的缺失增加了共培养中神经支配的百分比。DRG外植体与骨骼肌纤维共培养。
一DRG外植体在中央隔室（C）的Campenot室培养，培养5天；骨骼肌纤维与远端轴突一起加入侧隔（L）（共培养0天），最多10天的DRG培养（共培养5天）。b条Cx43肌纤维的免疫荧光飞行/飞行Cx45型飞行/飞行对照条件下的小鼠（对照条件；顶行），或用吗啉醇处理Cx43和Cx45（Cx43+Cx45 Mor；中行）和Cx43飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：使用针对神经丝200（NF；红色；左栏）和烟碱性乙酰胆碱受体ε亚基（AChRε；绿色；左中栏）的抗体共同培养DRG和肌纤维5天的MC小鼠（下排）。合并图像以识别神经支配的肌纤维（右中列）。箭头：有神经支配的肌纤维，箭头：无神经支配的肌纤维。比例尺：100μm。点矩形是神经支配肌纤维的放大图（右栏）。c（c）神经支配的肌纤维百分比。N个 = 5; 每个独立实验中至少记录35个肌纤维，每个值为平均值±SEM。从Cx43获得的结果飞行/飞行Cx45型飞行/飞行白条和Cx43代表小鼠飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：黑条MC小鼠***第页 < 0.001，与控制条件相比，Cx43+Cx45 Mor。###第页 < 0.001，用于43飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：MC与控制条件相比。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验。
图7
图7。培养骨骼肌纤维中Cx43和Cx45的缺失增加了共同培养中肌纤维周围轴突的数量。
一使用针对神经丝200（NF；红色；左侧）的抗体对DRG进行免疫荧光，转换为单色（黑白；中间）和反转（黑白；右侧）。比例尺：100μm。b条使用相控图像（虚线图；左侧）定位共培养中的肌纤维，并转换为黑色图像（虚点图；右侧）。c（c）远端轴突和以肌纤维（黑色）为中心间隔15μm的5个红色同心圆之间交叉点数量的量化。DRG与Cx43肌纤维共培养飞行/飞行Cx45型飞行/飞行处于对照状态（对照条件；顶行）或存在Cx43+Cx45 Mor（中行）和Cx43的小鼠飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：MC小鼠（最下面一行）在0天（右栏）或5天（左栏）共同培养。比例尺：50μm。d日交叉口平均值。N个 = 5; 每个独立实验中至少记录55个肌纤维，每个值为平均值±SEM。从Cx43获得的结果飞行/飞行Cx45型飞行/飞行白条和Cx43代表小鼠飞行/飞行Cx45型飞行/飞行：黑条MC小鼠***第页 < 0.001，以及**第页 < 0.005，共培养5天，而学生的共培养时间为0天吨测试。
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