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.2020年1月10日；11(1):174.
doi:10.1038/s41467-019-13889-6。

PHD1通过稳定亮氨酸tRNA合成酶以非羟化依赖的方式控制肌肉mTORC1

贡马尔·德赫斯特 1, 伊内斯·索罗·阿尔奈兹 1, Evi Masschelein公司 1, 科恩·韦斯 2 三, 吉莉安·菲茨杰拉德 1, 贝诺伊·斯梅宁 4 5, Sunghoon Kim先生 6, 路易丝·德尔迪克 7, 伯特·布莱奥 8, 皮特·卡梅里特 2 三, 利·布雷恩 4 5, Peppi Koivunen公司 9, 赵世民 10 11 12, 凯特里安·德博克 13
附属公司

PHD1通过稳定亮氨酸tRNA合成酶以非羟化依赖的方式控制肌肉mTORC1

贡马尔·德赫斯特等。 国家公社. .

摘要

mTORC1是肌肉质量的一个重要调节器，但它是如何被氧气和营养物质调节的尚不完全清楚。我们发现小鼠脯氨酰羟化酶结构域亚型1氧传感器的缺失（PHD1击倒对手)减少肌肉质量。PHD1击倒对手肌肉对亮氨酸的反应显示mTORC1激活受损，而生长因子或离心收缩的mTORC2激活保持不变。PHD1促进mTORC1活性的能力与其羟基化活性无关，但由亮氨酸tRNA合成酶（LRS）亮氨酸传感器的蛋白质含量降低引起。在机械方面，PHD1与LRS相互作用并使其稳定。这种相互作用在氧和氨基酸消耗期间得到促进，并保护LRS免受降解。最后，与年轻人相比，老年人的PHD1水平和肌肉LRS活性较低。综上所述，PHD1确保了在代谢稀缺发作后，mTORC1对亮氨酸的最佳反应。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。博士1-缺陷小鼠的肌肉质量较低。
显示肌肉重量的条形图(一)，瘦质量(b)，脂肪量(c（c）)、和体重(d日)WT（白色条）和PHD1击倒对手（红色条）雄性小鼠。e（电子）WT（黑线）和PHD1中纤维横截面积分布的量化（左面板）和代表性图片（右面板）击倒对手（红线）TA肌肉。（f）体外刺激的力-频率曲线比目鱼来自WT（黑线）和PHD1击倒对手（红线）雄性小鼠。克泛素蛋白酶体介导的蛋白降解相关基因在WT（白条）和PHD1 TA肌肉中的mRNA表达水平击倒对手（红色条）雌性老鼠。小时WT（白条）和PHD1 TA肌肉中LC3B和P62蛋白水平的代表性图片和western blot分析定量击倒对手（红色条）雌性老鼠。统计：双向方差分析测试，采用Holm–Sidak事后检验(e（电子）,（f）)或未成对t吨测试(一,b,c（c）,d日,克,小时) (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.001; ns不显著）。每个点代表一个鼠标(一,b,c（c）,d日,小时). 条形图和折线图表示平均值±SEM（误差线）。数据表示为WT的折叠变化(克,小时). 老挝国家电力公司趾长伸肌，燃气腓肠肌、TA胫骨前肌参见补充图1。源数据作为源数据文件提供。
图2
图2。PHD1是体内亮氨酸介导的mTORC1激活所必需的。
一来自WT（白条）和PHD1的TA肌肉中S6K1、RPS6和4E-BP1磷酸化的western blot分析的代表性图片（左侧面板）和定量（右侧面板）击倒对手（红色条）雌性小鼠灌胃生理盐水或亮氨酸30分钟后。代表性图片b和量化c（c）WT（白条）和PHD1的TA肌肉中的p-RPS6免疫荧光分析击倒对手（红条）小鼠灌胃生理盐水或亮氨酸30分钟后。强度测量以任意单位（AU）提供。d日WT中TA肌肉中嘌呤霉素掺入的代表性图片和western blot定量分析(n个 = 4） 和PHD1击倒对手雄性小鼠(n个 = 4） 亮氨酸灌胃后30分钟。雷帕霉素（rapam）作为阴性对照。AMPK磷酸化的western blot分析的代表性图片（顶面板）和量化（底面板）(e（电子）)和TSC2磷酸化(（f）)来自WT（白条）和PHD1的TA肌肉击倒对手（红条）小鼠灌胃亮氨酸30分钟后。克 红色1WT（白条）和PHD1的TA肌肉中的mRNA表达水平击倒对手（红色条）雌性老鼠。统计学：采用Holm–Sidak事后检验的双向方差分析(一,c（c）)或未成对t吨测试(e（电子）——克) (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.001; ns不显著）。每个点代表一个鼠标。条形图表示平均值±SEM（误差线）。数据表示为WT盐水的折叠变化(一,c（c）,e（电子）,（f）)或折叠更改为WT(克). 助教胫骨前肌参见补充图2。源数据作为源数据文件提供。
图3
图3。PHD1以细胞自主方式控制肌肉质量。
一显示肌肉特异性生成的示意图博士1缺陷小鼠（PHD1米KO)以及实验方案。b 博士1WT（白条）和PHD1在TA肌肉中的mRNA表达米KO（蓝色条）雄性和雌性小鼠。c（c）WT（白条）和PHD1 TA肌肉中p-S6K1、p-RPS6和p-4E-BP1的western blot分析的代表性图片（左侧面板）和定量（右侧面板）米KO（蓝色条）雄性和雌性小鼠灌胃生理盐水或亮氨酸30分钟后。d日WT（白条）和PHD1分化肌管中p-S6K1的western blot分析的代表性图片（左侧）和定量（右侧）击倒对手（红条）饥饿1小时（strv或饥饿）或用增加浓度的亮氨酸刺激30分钟（亮氨酸）的小鼠。e（电子）分化WT（带条）、PHD1中p-S6K1和PHD1表达的western blot分析的代表性图片（左面板）和定量（右面板）击倒对手（红色条），PHD1击倒对手+第1页OE-WT公司（浅灰色条）和PHD1击倒对手 + 第一阶段OE-MUT公司饥饿1小时（饥饿）或饥饿1小时后，用5 mM亮氨酸（亮氨酸）刺激30分钟后，肌管（深灰色条）。（f）不同亮氨酸转运体在WT TA中的mRNA表达（白条；n个 = 8） 和PHD1击倒对手（红色条n个 = 7） 雌性小鼠。克WT（白条）和PHD1中的血亮氨酸击倒对手（红条）小鼠灌胃生理盐水或亮氨酸30分钟后。小时WT（白条）和PHD1中GAS和TA的肌肉亮氨酸摄取击倒对手（红色条）雌性小鼠在亮氨酸灌胃30分钟后。统计学：采用Holm-Sidak事后检验的双向方差分析(c（c）,e（电子）)或未成对t吨测试(b,d日,（f）,克,小时) (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.001; ns不显著）。每个点代表一个鼠标(b,c（c）,克,小时)或独立实验的方法(d日,e（电子）). 条形图表示平均值±SEM（误差线）。数据表示为WT盐水的折叠变化(c（c）)，至WT亮氨酸5 mM(d日,e（电子）)或至WT(b,（f）). 另请参见补充图3。源数据作为源数据文件提供。
图4
图4。PHD1通过亮氨酸tRNA合成酶控制细胞内亮氨酸感应。
一——c（c）代表性图片和量化(d日)western blot分析WT（白条）和PHD1 TA肌肉中LRS、SESN1和SESN2蛋白水平米KO雄性和雌性（蓝条）小鼠。e（电子）第一阶段击倒对手用慢病毒转导肌源性祖细胞以过度表达myc-LRS（LRS）运行经验)，使用空向量（EV）作为对照。分化WT（白条）、PHD1中S6K1磷酸化和myc-LRS表达水平的western blot分析的代表性图片（左侧）和量化（右侧）击倒对手（红色条），PHD1击倒对手 + EV（浅灰色条）和PHD1击倒对手 + LRS公司运行经验饥饿1小时（饥饿）或用5 mM亮氨酸（亮氨酸）刺激30分钟后的肌管（深灰色条）。（f）RagA亮氨酸化（K）的western blot分析的代表性图片（左面板）和定量（右面板）卢142）WT（白色条）和PHD1中的水平击倒对手饥饿（饥饿）1小时或用不同剂量的亮氨酸（亮氨酸）刺激30分钟后的（红条）肌管。克RagA亮氨酸化（K）的western blot分析的代表性图片（左面板）和定量（右面板）卢142）来自WT（白条）和PHD1的TA水平击倒对手（红色条）雌性老鼠。代表性图片(小时)和量化(我)WT（白色条）和PHD1中mTOR（红色）和LAMP2（绿色）之间的共定位击倒对手（红色条）肌管。合并的（灰色）图片显示了mTOR和LAMP2之间的共定位分析的轮廓，该分析用于生成面板中显示的数据(我). 点表示来自三个独立实验的单个肌管的量化。统计学：采用Holm–Sidak事后检验的双向方差分析(e（电子）,我)或未成对t吨测试(d日,（f）,克) (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.001; ns不显著）。每个点代表一个鼠标。点表示四个独立实验的实验副本(e（电子）,（f）). 条形图表示平均值±SEM（误差线）。数据显示为折叠变为WT饥饿(e（电子）,（f）)或折叠更改为WT(d日,克). 另请参见补充图4。源数据作为源数据文件提供。
图5
图5。PHD1与LRS相互作用并控制LRS稳定性。
一HEK293T细胞转染myc-LRS、myc-LRS和标记-PHD1重量或myc-LRS和标记-PHD1MUT公司用抗标记抗体免疫沉淀细胞裂解物。使用抗myc抗体通过western blot分析确定myc-LRS的共沉淀。图中显示了一个具有代表性的实验。b体外羟化试验使用三H标记的体外翻译LRS（灰色条）或HIF1α（白色条；阳性对照），存在亲和力纯化的PHD1。c（c）HEK293T细胞转染myc-LRS或myc-LRS和标记-PHD1重量并用DMOG或饥饿4小时的氨基酸处理。细胞裂解物用抗标记抗体免疫沉淀。使用抗myc抗体通过western blot分析确定myc-LRS的共沉淀。图中显示了一个具有代表性的实验。d日WT（黑线）和PHD1中LRS蛋白水平的western blot分析的代表性图片（左面板）和量化（右面板）击倒对手（红线）肌管暴露于环己酰亚胺（Chx）的时间不同。点表示两个独立实验的平均值。e（电子）WT（黑线）和PHD1中LRS蛋白水平的时程分析击倒对手（红线）暴露于氨基酸饥饿的肌管。点代表三个独立实验的平均值。（f）WT（黑线）和PHD1中LRS蛋白水平的时程分析击倒对手（红线）肌管暴露于缺氧（1%氧气）。点表示3个独立实验的平均值。统计：双向方差分析（ine（电子）和（f），指示交互作用）t吨测试(d日) (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.001; ns不显著）。条形图和折线图表示平均值±SEM（误差线）。数据显示为WT 0 h的折叠变化(d日,e（电子）,（f）). 另请参见补充图5。源数据作为源数据文件提供。
图6
图6。PHD1水平和LRS活性在老化过程中下降。
一PHD1和LRS蛋白水平的western blot分析的代表性图片（左面板）和定量（右面板）股外侧肌年轻（白色条）和老年（灰色条）志愿者的活检。代表性免疫荧光图片(b)和量化(c（c）)年轻和老年骨骼肌中PHD1（红色）、Hoechst核染色（蓝色）和小麦胚芽凝集素（WGA，白色）。箭头表示原子核。d日RagA亮氨酸化（K）的western blot分析的代表性图片（左面板）和定量（右面板）卢142）水平股外侧肌年轻（白色条）和老年（灰色条）志愿者的活检。统计：未配对t吨测试(一) (*对 < 0.05; **对 < 0.01; ***对 < 0.001; ns不显著）。点代表不同志愿者的数值。条形图表示平均值±SEM（误差线）。数据以倍数变化的形式呈现给年轻人(一,d日). 源数据作为源数据文件提供。
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