Prolyl hydroxylase substrate adenylosuccinate lyase is an oncogenic driver in triple negative breast cancer

doi:10.1038/s41467-019-13168-4

.2019年11月15日；10(1):5177.

doi:10.1038/s41467-019-13168-4。

脯氨酸羟化酶底物腺苷酸琥珀酸裂解酶是三阴性乳腺癌的致癌驱动因素

附属公司

¹北卡罗来纳大学医学院Lineberger综合癌症中心，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。
²北卡罗来纳大学神经科学中心遗传学系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。
^三北卡罗来纳大学卡罗来纳州发育障碍研究所北卡罗来那大学神经科学中心，北卡罗莱纳州教堂山，27599，美国。
⁴英国爱丁堡癌症研究中心，IGMM，爱丁堡大学，爱丁堡，EH4 2XR，英国。
⁵美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院药理学和癌症生物学系，27710。
⁶美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学病理学和实验医学系，27599。
⁷美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院儿科，邮编：30322。
⁸查尔斯大学第一医学院儿科和青少年医学系罕见疾病研究室和捷克布拉格布拉格综合大学医院。
⁹荷兰马斯特里赫特大学医学中心临床遗传学系。
¹⁰北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。
¹¹北卡罗来纳大学医学院Lineberger综合癌症中心，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。
¹²北卡罗来纳大学病理学和实验医学系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。
¹³北卡罗来纳大学药理学系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。
¹⁴美国德克萨斯州达拉斯市犹他州西南医学中心病理科，邮编75390。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。

PMID： 31729379
预防性维修识别码：项目经理C6858455
DOI（操作界面）： 10.1038/s41467-019-13168-4

脯氨酸羟化酶底物腺苷酸琥珀酸裂解酶是三阴性乳腺癌的致癌驱动因素

贾达·祖罗等。国家公社. 2019.

.2019年11月15日；10(1):5177.

doi:10.1038/s41467-019-13168-4。

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¹北卡罗来纳大学医学院Lineberger综合癌症中心，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。
²北卡罗来纳大学神经科学中心遗传学系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。
^三北卡罗来纳大学卡罗来纳州发育障碍研究所北卡罗来那大学神经科学中心，北卡罗莱纳州教堂山，27599，美国。
⁴英国爱丁堡癌症研究中心，IGMM，爱丁堡大学，爱丁堡，EH4 2XR，英国。
⁵美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院药理学和癌症生物学系，27710。
⁶美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学病理学和实验医学系，27599。
⁷美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院儿科，邮编：30322。
⁸查尔斯大学第一医学院儿科和青少年医学系罕见疾病研究室和捷克布拉格布拉格综合大学医院。
⁹荷兰马斯特里赫特大学医学中心临床遗传学系。
¹⁰北卡罗来纳大学生物化学和生物物理系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。
¹¹北卡罗来纳大学医学院Lineberger综合癌症中心，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。
¹²北卡罗来纳大学病理学和实验医学系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。
¹³北卡罗来纳大学药理学系，北卡罗来那州教堂山，27599，美国。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。
¹⁴美国德克萨斯州达拉斯市犹他州西南医学中心病理科，邮编75390。Qing.Zhang@utsouthwestern.edu。

PMID： 31729379
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摘要

蛋白质羟基化影响蛋白质的稳定性、活性和相互作用组，从而导致包括癌症在内的各种疾病。然而，羟化反应的短暂性阻碍了羟化酶底物的鉴定。通过开发酶底物捕获策略，结合TAP-TAG或正交GST-纯化，然后进行质谱分析，我们确定腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）是三阴性乳腺癌（TNBC）的EglN2羟化酶底物。ADSL在TNBC中的表达高于其他乳腺癌亚型或正常乳腺组织。在体外和体内，ADSL基因敲除会损害TNBC细胞的增殖和侵袭性。综合转录组学和代谢组学分析表明，ADSL通过一种需要ADSL脯氨酸24羟基化的机制调节cMYC蛋白水平，从而激活致癌cMYC途径。羟化酶抑制剂ADSL通过影响腺苷水平，抑制长非编码RNA MIR22HG的表达，从而上调cMYC蛋白水平。我们的研究结果强调了ADSL羟基化在控制cMYC和TNBC肿瘤发生中的作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
基板捕获策略将ADSL识别为TNBC中的EglN2基板。一感染编码野生型（WT）或催化死亡突变型（H358A）FLAG-和HA-标记的EglN2慢病毒的T47D细胞的全细胞提取物（WCE）的免疫印迹（IB）和裂解物的免疫沉淀（IP），并按指示隔夜治疗。b条感染编码EglN2-WT或-H358A的慢病毒的MDA-MB-231细胞的WCE和裂解物的IB，并按指示隔夜治疗。**c（c）**羟化酶（此处为EglN2）底物屏幕的示意图。d日输入的IB（用于下拉的蛋白质量的1%）和隔夜处理的MDA-MB-231细胞裂解物的GST下拉。**e（电子）**用所示质粒转染MDA-MB-231细胞的WCE的IB和裂解物的IP，并按所示过夜处理。**（f）**用DMOG处理MDA-MB-231中的内源性EglN2和ADSL IP。克,小时,我体外翻译ADSL的输入IB和GST下拉(克,我)和重组EglN2(小时). 在b条,**c（c）**,d日、和**e（电子）**，缺氧为1%O₂DMOG浓度为1 mM。源数据以源数据文件的形式提供

图2
ADSL在TNBC中起着至关重要的作用。一在三个不同的数据集中，不同亚型乳腺癌的ADSL mRNA表达（TCGA代表癌症基因组图谱）。正方形图的中心线表示中位数，上四分位数和下四分位数的边界，以及1.5×四分位数范围的晶须。b条TNBC和TCGA中正常乳腺组织中ADSL mRNA的表达，以及配对TNBC患者衍生的非肿瘤（n）和肿瘤（t）乳腺组织裂解产物的IB。**c（c）**IB显示ADSL耗尽后指示细胞的典型二维增殖。d日,**e（电子）**的代表性图像(d日)独立于主持人的增长和(**e（电子）**)感染ADSL sgRNA#5和#6（sg5和sg6）或sgRNA控制（Ctrl）的MDA-MB-231细胞的侵袭。图表表示两个独立实验的平均值±SEM，每个实验重复进行(d日)和三个独立的实验(**e（电子）**). ***P（P）* < 使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的多重比较试验计算0.01。**（f）**过度表达多西环素（dox）诱导的ADSL的MDA-MB-231细胞裂解产物的IB，感染了指示的病毒并按指示进行治疗。克,小时的代表性图像(克)独立于主持人的增长和(小时)过度表达dox-inducible ADSL的MDA-MB-231细胞的侵袭，感染并按指示治疗。图表示四个独立样本的平均值±SEM**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较试验计算0.001。源数据作为源数据文件提供

图3
ADSL是TNBC肿瘤发生和肺部定植所必需的。一将感染ADSL sgRNA#6（sg6）或对照sgRNA（Ctrl）的MDA-MB-231荧光素酶表达细胞原位注射到NOD SCID Gamma（NSG）小鼠乳腺脂肪垫后指定周的典型生物发光图像。b条生物发光成像的量化。**c（c）**解剖后肿瘤的代表性图像和肿瘤重量的量化。d日将感染ADSL sgRNA#6（sg6）或对照sgRNA（Ctrl）的MDA-MB-231荧光素酶表达细胞注射到NSG小鼠尾静脉后指定周的典型生物发光图像。**e（电子）**注射后指定周内原始发光亮度的斑点印迹表示。**（f）**生物发光成像的量化。对于(b条), (**e（电子）**)、和(**（f）**)，Mann-Whitney检验用于计算*P（P）*值。对于(**c（c）**)，双尾学生t吨-使用了测试。误差条代表SEM**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001. 源数据作为源数据文件提供

图4
ADSL在脯氨酸24上被EglN2羟基化。一在存在或不存在重组EglN2的情况下，GST-ADSL的体外羟基化。条形图表示氧化的含P24肽与ADSL全蛋白强度的标准化比率。误差条代表SEM，n个 = 4, **P（P）* < 使用双尾Student’s计算0.05t吨-测试。b条脯氨酸羟化酶肽YASPEMCFVFSDR的碎片光谱检测如下所述的实验程序(一).c（c）,d日用所示质粒转染293T细胞的WCE的IB和裂解物的IP，并按所示过夜处理。**e（电子）**MDA-MB-231细胞裂解物的IB过度表达所示的dox-inducible ADSL，按照所示进行转导和处理。**（f）**MDA-MB-231细胞过度表达所示的dox-inducible ADSL、转导和治疗的二维增殖的代表性图像。克WT、P24A或R426H ADSL在其底物琥珀酸腺苷（SAMP）或琥珀酸氨基咪唑甲酰胺核苷（SAICAR）存在下的酶活性。条形图表示ADSL活动与WT ADSL相比的标准化百分比。误差条代表SEM，n个 = 4, **P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较试验计算0.001。源数据作为源数据文件提供

图5
ADSL通过调节腺苷水平来控制cMYC蛋白水平。一ADSL耗竭影响的代谢途径概述。b条对照组和ADSL敲除MDA-MB-231细胞之间cMYC靶基因的基因集富集分析（GSEA）。**c（c）**ADSL缺失时cMYC靶基因表达的热图。d日来自成对TNBC患者衍生非肿瘤（n）和肿瘤（t）乳腺组织的裂解物的IB。**e（电子）**MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞裂解产物的IB，用指示的慢病毒转导。**（f）**过表达多西环素（dox）诱导的ADSL的MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞裂解产物的IB，用指示的慢病毒转导并按指示处理。克过表达dox-inducible WT或P24A ADSL的MDA-MB-231细胞裂解物的IB，用指示慢病毒转导。小时MDA-MB-231细胞二维增殖的代表性图像，按指示转导和处理。我MDA-MB-231细胞裂解物的IB，用指示的慢病毒转导并按指示处理。源数据作为源数据文件提供

图6
ADSL控制cMYC负调节器*MIR22HG公司*表达式。一差异表达结果散点图：−log10 FDR-调整*P（P）*-使用DESeq2绘制所有基因的每个gRNA与对照的比较值，无论其重要性如何。b条,**c（c）** *MIR22HG公司*ADSL耗竭后的mRNA表达(b条)MDA-MB-231和(**c（c）**)MDA-MB-436细胞。图表表示平均值±SEM，n个 = 3 (b条)和n个 = 4 (**c（c）**).d日表达之间的皮尔逊相关性*ADSL公司*和*MIR22HG公司*来自TCGA数据集的TNBC患者。**e（电子）** *MIR22HG公司*mRNA表达和**（f）**转染MDA-MB-231细胞后cMYC蛋白水平*MIR22HG公司*表达质粒或空载体。克 *MIR22HG公司*mRNA表达和小时三种独立的siRNAs靶向转染MDA-MB-231细胞后cMYC蛋白水平*22毫米汞柱*或siRNA控制。我 *MIR22HG公司*mRNA表达，j个二维，以及k个多西环素（doxycycline，dox）诱导的MDA-MB-231细胞中存在或不存在的三维集落形成*MIR22HG公司*表达慢病毒。图表示四组独立样本的平均值±SEM(我)和两个独立的实验，每个实验重复进行(k个).我,米 *MIR22HG公司*ADSL控制或敲除MDA-MB-231细胞中mRNA的表达(我)WT和(米)P24A ADSL。n个 *MIR22HG公司*ADSL控制或敲除MDA-MB-231细胞中的mRNA表达（腺苷浓度为50µM）。中的图形(我), (米)、和(n个)表示平均值±SEM，n个 = 3o（o）EglN2羟基化ADSL控制cMYC和cMYC靶基因表达的拟议机制示意图**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001是使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较测试计算的(b条), (**c（c）**)、和(克). 在(**e（电子）**), (我)、和(k个),*P（P）*-使用双尾Student’st吨-测试。在(我), (米)、和(n个),*P（P）*-使用单向方差分析和Tukey多重比较测试计算值。源数据作为源数据文件提供

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