VDAC1 is essential for neurite maintenance and the inhibition of its oligomerization protects spinal cord from demyelination and facilitates locomotor function recovery after spinal cord injury

doi:10.1038/s41598-019-50506-4

.2019年10月1日；9(1):14063.

doi:10.1038/s41598-019-50506-4。

VDAC1对神经突起的维持至关重要，抑制其寡聚化可保护脊髓免于脱髓鞘，并有助于脊髓损伤后运动功能的恢复

维拉·帕斯科恩¹, 比阿特丽斯·辛特拉·莫雷纳², 费利佩·费尔南德斯·科雷亚², 乔瓦娜·罗西·贝尔特拉姆², 古斯塔沃·比斯波·多斯桑托斯^三, 亚历山大·福加萨·克里斯坦^三, 亚历山德拉·平原纪原（Alexandre Hiroaki Kihara）⁴

附属公司

¹巴西圣贝纳多多坎波ABC联邦大学马特马提卡中心（Centro de Matemática）。vera.paschon@gmail.com。
²巴西圣贝纳多多坎波ABC联邦大学马特马提卡中心（Centro de Matemática）。
^三巴西圣保罗圣保罗大学医学院创伤研究所。
⁴Matemática中心，Computação e Cognição，美国广播公司联邦大学，São Bernardo do Campo，SP，巴西。alexandrekihara@gmail.com。

PMID： 31575916
预防性维修识别码： PMC6773716
内政部： 10.1038/s41598-019-50506-4

VDAC1对神经突起的维持至关重要，抑制其寡聚化可保护脊髓免于脱髓鞘，并有助于脊髓损伤后运动功能的恢复

维拉·帕斯科恩等。科学代表. 2019.

.2019年10月1日；9(1):14063.

doi:10.1038/s41598-019-50506-4。

作者

维拉·帕斯科恩¹, 比阿特丽斯·辛特拉·莫雷纳², 费利佩·费尔南德斯·科雷亚², 乔万娜·罗西·贝尔特拉姆², 古斯塔沃·比斯波·多斯桑托斯^三, 亚历山大·福加萨·克里斯坦^三, 亚历山德拉·平原纪原（Alexandre Hiroaki Kihara）⁴

附属公司

¹巴西圣贝纳多多坎波ABC联邦大学马特马提卡中心（Centro de Matemática）。vera.paschon@gmail.com。
²巴西圣贝纳多多坎波ABC联邦大学马特马提卡中心（Centro de Matemática）。
^三巴西圣保罗圣保罗大学医学院创伤研究所。
⁴巴西圣贝纳多多坎波ABC联邦大学马特马提卡中心（Centro de Matemática）。alexandrekihara@gmail.com。

PMID： 31575916
预防性维修识别码： PMC6773716
内政部： 10.1038/s41598-019-50506-4

摘要

在神经退行性变过程中，线粒体参与了几个细胞间信号通路。电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC1）是一种线粒体孔蛋白，在许多神经病理学过程中参与细胞代谢和凋亡的内在途径。在脊髓损伤（SCI）中，在原代细胞死亡后，包括释放促炎分子的次级反应会触发细胞凋亡、炎症和脱髓鞘，通常会导致运动功能丧失。在这里，我们研究了VDAC1在脊髓损伤引发的神经退行性变中的功能作用。我们首先确定，通过特异性吗啉反义核苷酸（MO）体外靶向消融VDAC1可明显促进轴突回缩，而VDAC1低聚的药理学阻断剂（4,4'-二异硫氰基二苯乙烯-2,2'-二磺酸，DIDS）不会引起这种作用。我们接下来确定，在SCI后，VDAC1发生构象变化，包括寡聚化和N末端暴露，这是触发凋亡信号的重要步骤。鉴于此，我们研究了脊髓损伤后体内应用DIDS的效果。有趣的是，阻断VDAC1寡聚化可减少凋亡细胞的数量，而不会干扰神经炎症反应。DIDS可减少大量少突胶质细胞的死亡，为无可争议的运动功能恢复服务。综上所述，我们的结果表明，预防VDAC1齐聚可能有助于SCI的临床治疗。

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利益冲突声明

A.H.K.是《科学报告》编辑委员会的成员。其他作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
吗啉反义核苷酸（MOs）对电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC1）消融的影响和4,4′-二异硫氰基二苯乙烯-2,2′-二磺酸（DIDS）对原代脊髓细胞培养的药理阻断。(一)脊髓原代细胞培养物中的VDAC1和具有代表性的氨基黑（AB）带用打乱（SCR）或VDAC1 MO处理，并量化VDAC1的相应光密度。(b)受特定条件影响后的3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）还原酶活性图，包括阴性对照（CTL−）、阳性对照（CTL+）、磷酸盐缓冲盐（PBS）、DIDS、SRC和MO处理。细胞培养物处理后的代表性图像(**c（c）**)PBS或(d日)25uM DIDS，使用抗βIII微管蛋白（绿色）进行免疫荧光实验，并用4′-6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI，蓝色）进行复染。(**e（电子）**)指示PBS和DIDS处理后神经元分支的轴突长度和半径的图。细胞培养物处理后的代表性图像(**（f）**)SCR寡核苷酸或(克)VDAC1 MO在免疫荧光实验中使用抗βIII微管蛋白（绿色），并用DAPI（蓝色）复染。(小时)显示SCR和MO治疗后神经元分支的轴突长度和半径的图表。条形图表示平均值的标准误差。比例尺：50μm**P（P）* < 0.05.

图2
在大鼠脊髓横切面用4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）对特定细胞标记物（红色）进行电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC1，绿色）的双重标记免疫荧光分析。大鼠脊髓背区VDAC1和(一)胶质纤维酸性蛋白（GFAP）(**c（c）**)胆碱乙酰转移酶（ChAT），以及(**e（电子）**)钙结合蛋白（CB），用DAPI复染。大鼠脊髓腹侧区VDAC1和(b)GFAP、(d日)ChAT和(**（f）**)CB，用DAPI复染。像素轮廓分析揭示了绿色和红色信号的共定位。所选区域的高倍视图证实了绿色（箭头）和红色（箭头）信号的共同定位。比例尺：50μm。

图3
脊髓损伤（SCI）24小时后用4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染电压依赖性阴离子选择性通道1（VDAC1）的Western blot和免疫荧光分析。(一)在假对照组和SCI动物的脊髓样品中使用抗VDAC1 PORIN、抗VDAC1N末端的代表性western印迹带。Amido黑带被用作加载控制。(b)从假对照组和脊髓损伤动物脊髓样品中使用抗PORIN和抗N项获得的条带中量化光密度。脊髓腹侧区域的代表性图像(**c（c）**)假控制和(d日)SCI动物用抗PORIN（绿色）染色，用DAPI（蓝色）复染，用高倍镜观察各自选定区域。(**e（电子）**)显示假对照组和SCI动物中抗PORIN标记像素强度的图表。脊髓腹侧区域的代表性图像(**（f）**)假控制和(克)SCI动物用抗N-末端（绿色）染色，用DAPI（蓝色）复染，用高倍镜观察各个选定区域。(小时)显示假对照组和SCI动物中N项标记像素强度的图表。条形图表示平均值的标准误差。比例尺：50μm**P（P）* < 0.01.

图4
磷酸缓冲盐水（PBS）处理大鼠脊髓横切面中用4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染的电离钙结合适配器分子1（Iba-1）、分化簇86（CD86）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的免疫荧光和Western blot分析或伤后24小时4,4′-二异硫氰基二苯乙烯-2,2′-二磺酸（DIDS）。腹部区域的代表性图像(一)PBS-和(b)DIDS处理组用Iba-1（绿色）染色，用DAPI（蓝色）复染，各自选定区域和标记骨骼的高放大视图显示其体素。(**c（c）**)显示PBS和DIDS处理组中Iba-1-阳性细胞平均分支长度的图表。腹部区域的代表性图像(d日)PBS-和(**e（电子）**)DIDS处理组用CD86（绿色）染色，用DAPI（蓝色）复染，用高倍镜观察各个选定区域。(**（f）**)显示PBS和DIDS处理组中CD86阳性细胞数量的图表。腹部区域的代表性图像(克)PBS-和(小时)DIDS处理组用iNOS（绿色）染色，用DAPI（蓝色）复染，用高倍镜观察各个选定区域。(我)显示PBS和DIDS处理组iNOS阳性细胞数量的图表。(j个)PBS和DIDS处理动物脊髓样品的代表性iNOS和氨基黑（AB）带。iNOS带光密度的量化，比较PBS和DIDS处理的动物。条形图表示平均值的标准误差。比例尺：50μm。

图5
末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测和免疫荧光实验；用磷酸缓冲盐水（PBS）或4，4′-二异硫氰基二苯乙烯-2，2′-二磺酸（DIDS）在大鼠脊髓损伤横截面上涂抹后，用4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。脊髓损伤24小时后切片的典型图像(一)PBS-和(b)DIDS处理的动物用TUNEL染色。(**c（c）**)显示PBS和DIDS处理动物切片中TUNEL阳性细胞数量的图表。损伤后24小时脊髓切片的代表性图像，描绘的区域指示损伤的病灶和周围区域(d日)PBS-和(**e（电子）**)DIDS处理的动物用TUNEL染色。(**（f）**)显示PBS和DIDS处理动物切片中从损伤病灶到邻近区域的TUNEL阳性细胞数量的图表。脊髓损伤后24小时切片的典型图像(克)PBS-和(小时)用抗少突胶质细胞特异性蛋白（OSP，绿色）、TUNEL（红色）和DAPI（蓝色）对DIDS处理过的动物进行染色，并对各自选择的区域进行高倍放大。(我)显示也用TUNEL标记的OSP阳性细胞数量的图表。脊髓损伤后24小时切片的典型图像(j个)PBS-和(k个)DIDS处理的动物用抗神经色素泛神经丝标记物（NCP）、TUNEL（红色）和DAPI（蓝色）染色，并对各自选择的区域进行高倍放大。(我)显示也用TUNEL标记的NCP阳性细胞数量的图。条形图表示平均值的标准误差。a、b、d和e的比例尺：250μm。g、h、j和k的比例尺：50μm**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01.^#*P（P）* < 在双向方差分析中，因子治疗（PBS vs.DIDS）为0.01。

图6
脊髓损伤（SCI）6周后的磷酸缓冲盐水（PBS）或4,4′-二异硫氰基二苯乙烯-2,2′-二磺酸（DIDS）矢状切面受累面积和轴突密度分析。脊髓矢状截面的代表性图像(一)PBS-和(b)DIDS处理的动物用抗胶质纤维星形细胞抗体（GFAP，红色）染色。虚线表示脊髓机械损伤后GFAP阴性区域。(**c（c）**)量化损伤区域，对应于脊髓中GFAP阴性区域。脊髓矢状切面的代表性图像(d日)PBS-和(**e（电子）**)DIDS处理的动物用抗βIII微管蛋白染色（绿色）。(**（f）**)抗βIII微管蛋白光密度的定量。条形图表示平均值的标准误差。比例尺：250μm**P（P）* < 0.05. ***P（P）* < 0.01.

图7
应用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或4,4′-二异硫氰基二苯乙烯-2,2′-二磺酸（DIDS）后，脊髓损伤（SCI）后的Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分和运动功能恢复。(一)显示受伤后6周内接受PBS和DIDS的动物的BBB评分的图表。(b)图表显示了6周内受伤后接受PBS和DIDS的动物的BBB亚核心。脊髓矢状截面的代表性图像(**c（c）**)控件和(d日)6周后，DIDS处理的动物用苏木精和伊红（HE）染色。虚线表示受影响的区域。条形图表示平均值的标准误差。比例尺：250μm**P（P）* < 与PBS组的相应时间点相比，0.05。^#*P（P）* < 在双向方差分析中，因子治疗（PBS vs.DIDS）为0.01。

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