RNA Interactions Are Essential for CTCF-Mediated Genome Organization

doi:10.1016/j.molcel.2019.08.015

.2019年11月7日；76（3）：412-422.e5。

doi:10.1016/j.molcel.2019.08.015。 Epub 2019年9月12日。

RNA相互作用对CTCF介导的基因组组织至关重要

附属公司

¹美国纽约州纽约市NYULSoM生物化学和分子药理学系；霍华德·休斯医学院，美国纽约州纽约市纽约大学朗根健康学院，电子地址：ricardo.saldana-meyer@nyulangone.org。
²美国纽约州纽约市NYULSoM病理科。
^三美国纽约州纽约市NYULSoM生物化学和分子药理学系；霍华德·休斯医学院，纽约大学朗根健康学院，纽约州纽约市，美国。
⁴墨西哥墨西哥城墨西哥国立自治大学Celular鱼类研究所Genética分子部。
⁵美国加州旧金山格莱斯顿学院，邮编94158；Roddenberry干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格拉德斯通，邮编94158。
⁶美国加州旧金山格莱斯顿学院，邮编94158；位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿的Roddenberry干细胞生物学和医学中心，邮编94158；加利福尼亚大学儿科系，旧金山，旧金山，加利福尼亚州94143，美国；加利福尼亚大学心血管研究所，旧金山，旧金山，加利福尼亚94158，美国。
⁷美国纽约州纽约市NYULSoM病理科；应用生物信息学实验室，纽约大学医学院，纽约，NY 10016，美国。
⁸美国纽约州纽约市NYULSoM生物化学和分子药理学系；霍华德·休斯医学院，美国纽约州纽约市纽约大学朗根健康学院，电子地址：danny.reinberg@nyulangone.org。

PMID： 31522988
PMCID公司： PMC7195841号
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2019.08.015

RNA相互作用对CTCF介导的基因组组织至关重要

里卡多·萨尔达纳·梅耶等。分子电池. 2019.

.2019年11月7日；76（3）：412-422.e5。

doi:10.1016/j.molcel.2019.08.015。 Epub 2019年9月12日。

附属公司

¹美国纽约州纽约市NYULSoM生物化学和分子药理学系；霍华德·休斯医学院，美国纽约州纽约市纽约大学朗根健康学院，电子地址：ricardo.saldana-meyer@nyulangone.org。
²美国纽约州纽约市NYULSoM病理科。
^三美国纽约州纽约市NYULSoM生物化学和分子药理学系；霍华德·休斯医学院，纽约大学朗根健康学院，纽约州纽约市，美国。
⁴墨西哥墨西哥城墨西哥国立自治大学Celular鱼类研究所Genética分子部。
⁵美国加州旧金山格莱斯顿学院，邮编94158；罗德恩贝里干细胞生物学和医学中心，位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿，邮编94158。
⁶美国加州旧金山格莱斯顿学院，邮编94158；位于美国加利福尼亚州旧金山格莱斯顿的Roddenberry干细胞生物学和医学中心，邮编94158；加利福尼亚大学儿科系，旧金山，旧金山，加利福尼亚州94143，美国；加利福尼亚大学心血管研究所，旧金山，旧金山，加利福尼亚94158，美国。
⁷美国纽约州纽约市NYULSoM病理科；应用生物信息学实验室，纽约大学医学院，纽约，NY 10016，美国。
⁸美国纽约州纽约市NYULSoM生物化学和分子药理学系；霍华德·休斯医学院，美国纽约州纽约市纽约大学朗根健康学院，电子地址：danny.reinberg@nyulangone.org。

PMID： 31522988
PMCID公司： PMC7195841号
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2019.08.015

摘要

CCCTC-结合因子（CTCF）在基因组组织中的作用已成为一个重要的研究领域，但CTCF动态促进基因组组织的机制尚不清楚。我们之前发现，CTCF与大量内源性RNA结合，促进其自我结合。在这方面，我们现在报告了破坏CTCF与染色质关联的两个独立特征：通过其11个锌指中的2个突变抑制转录和破坏CTCF-RNA相互作用，而CTCF与其同源DNA位点的结合不需要锌指1（ZF1）或锌指10（ZF10）。这些突变改变了基因表达谱，因为CTCF突变体失去了形成染色质环的能力，从而失去了隔离染色质结构域和调节CTCF长距离基因组相互作用的能力。我们的结果表明了CTCF介导的RNA相互作用作为基因组组织结构组成部分的重要性。

关键词：CTCF；RNA结合；RNA缺乏突变；TAD；染色质结构域；染色质环；染色质组织；基因表达；转录抑制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

权益声明

D.R.是Constellation Pharmaceuticals和Fulcrum Therapeutics的联合创始人。R.S.-M是RNA生命科学咨询公司的联合创始人。所有其他作者都声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。 — **图1.转录抑制主要破坏TSS中CTCF的结合**
在DRB和雷公藤内酯醇的共同培养下，mESCs中的转录被抑制4小时。用二甲基亚砜培养的细胞作为对照。（A）显示以CTCF绑定站点为中心并按等级排序的CTCF ChIP-seq热图。相应的平均密度分布图绘制在热图顶部，以说明二甲基亚砜和TI的4小时之间的差异。B）TI 4小时后，一组峰显示出显著降低的CTCF富集。TSS的重叠峰以蓝色突出显示。（C） ChIP-seq与（A）相同但以TSS为中心的平均密度分布。（D）显示转录抑制后CTCF结合位点丢失的基序亲和力得分的箱线图，与对照组中的一组随机CTCF连接位点相比（Mann-Whitney检验，p<0.0001）。（E）与Slain2基因TSS结合减少的CTCF峰值的典型示例。DMSO的ChIP-seq轨迹（灰色）和TI的4h轨迹（红色）重叠以进行比较。（F） 5C热图描述了限制性片段之间在4 Mb区域周围的相互作用频率*霍克斯A*聚类（数据在15kb窗口中装箱；步长5kb；显示中值）。对比5C热图显示TI后相互作用增加（红色）和减少（蓝色）。上面重叠的ChIP-seq轨迹说明CTCF结合减少。较深的颜色表示交互频率增加。（G）放大到由CTCF位点分隔的染色质域（顶部）。DMSO的重叠ChIP-seq轨迹（灰色）和TI的4小时轨迹（红色）表明矩形（底部）中的回路的CTCF绑定没有变化。

图2。 — **图2 ZF1和ZF10中的缺失独立地消除了CTCF与RNA的结合**
（A） WT CTCF已知域的示意图，其11个锌指编号（顶部）；平滑剩余水平RBR-ID评分（He et al.，2016），沿一级层序绘制（底部）。（B） FACS分析突出显示GFP+或mCherry+CTCF-AID-GFP mESC的百分比，包括或不包括CTCF:WT、ZF1Δ或ZF10Δ。（C）所有救援细胞系的免疫沉淀显示CTCF和Rad21的免疫印迹。（D）与每次救援一起孵育的GFP-CTCF的代表性图像，用GFP抗体免疫沉淀并免疫CTCF（左）；每个救援蛋白相对于GFP-CTCF的柱状图定量（n＝5）（右）。（E）在mESCs中稳定表达WT和突变CTCF的PAR-CLIP。放射自显影术³²P标记RNA（顶部）和对照蛋白印迹（中部和底部）。（F） CTCF的ZF1和ZF10示意图；乳腺癌和子宫内膜癌中改变锌结合的突变以黑色显示；不改变锌结合的突变显示为蓝色，RBR-ID缺失显示在括号内。

图3。 — **图3 RBR缺失之间的基因表达缺陷部分保留**
（A）基于主成分分析（PCA）的WT（灰色）、ZF1Δ（黑色）和ZF10Δ（红色）救援细胞系单细胞RNA-seq数据表示。每个点代表一个单元格，点是基于PCA排列的。括号中注明了每个条件下测序的最终细胞数。（B）描绘scRNA-seq差异表达基因的热图。（C）维恩图显示了不同条件和显著性水平下差异表达基因之间的重叠。（D）显示启动子区域或基因体中至少有一个CTCF结合位点的基因百分比的条形图。（E）箱线图显示了与基因随机样本相比（B）中所示DEG内CTCF结合位点的基序亲和力得分（Mann-Whitney检验，p<0.0001）。

图4。 — **图4 CTCF中RBR的缺失干扰其染色质结合**
（A） WT（灰色）、ZF1Δ（黑色）和ZF10Δ（红色）救援细胞系的CTCF ChIP-seq。通过对CTCF结合位点进行定心和等级排序生成热图。显示了ZF1Δ（顶部）或ZF10Δ（底部）的损失。（B）*从头开始*（A）中的结合位点被称为基序发现，第八个位置被一个黑盒子包围，其中ZF1Δ特别喜欢A到G。（C）箱线图显示了（A）中CTCF结合位点与未改变位点的模体亲和力得分（Mann-Whitney检验，p<0.0001）。（D）条形图表示（A）中CTCF位点的前三个基因组区域。（E和F）差异表达基因的平均表达水平*Cdkn2a型*（E）以及每个条件下对应的ChIP-seq轨迹（F）。

图5。 — **图5 RBR突变体干扰染色质环**
（A）聚集峰分析（APA）用于测量在WT救援中由HICCUPS注释的染色质环的聚集强度。环路强度由图中心的震源富集程度表示。APA得分显示在左下角。（B）表示救援条件之间APA得分的条形图。（C）条形图，表示HICCUS对每个个体条件注释的染色质环的数量。（D）代表性接触矩阵（分辨率为5 kb）表明，WT救援（左）中的染色质环在ZF1Δ（中）中消失，或在ZF10Δ（右）中失去强度，而CTCF结合在其中一个锚处丢失。（E）与（D）相同，但在本例中，CTCF在所有条件下都保持约束。

图6。 — **图6 RBR突变体干扰染色质环**
（A）对于普通域，WT与ZF1Δ的域内相互作用变化，以及WT与QF10Δ的相互作用变化。CTCF突变拯救与域内相互作用的获得（红色）和损失（蓝色）相关。（B）方框图表示DEG和染色质结构域之间的相关性，染色质结构域的相互作用增加。只有ZF1Δ的下调基因与域内相互作用的增加显著相关，而所有其他基因均不显著相关。（C）代表性接触矩阵（分辨率为5kb）显示左侧的染色质环锚与*协同效应2*基因。在WT拯救（左）中，ZF1Δ（中）中的环消失，ZF10Δ（右）中的环稳定，而CTCF结合仅在ZF1Δ的启动子和锚处丢失。Syne2仅在ZF1Δ条件下上调。（D）由两个CTCF蛋白（绿色）和凝集素环（蓝色）组成的染色质环的图形表示，在WT条件下由RNA稳定（左图）。观察到RNA结合缺陷突变体（ZF1Δ和ZF10Δ）的两个结果：（1）环丢失，CTCF蛋白失去与染色质的结合（右上图），或（2）两个CTCF蛋白质仍然与染色质结合，但染色质环仍然丢失（右下图）。

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