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.2019年7月25:8:e48625。
doi:10.7554/eLife.48625。

非编码RNA调节基因组稳定性需要PUMILIO而非RBMX结合诺拉德

马哈茂德·埃尔金迪 1 2, 弗洛里安·科普 1, 穆罕默德·古达尔齐 三, 弗雷德里克·雷菲尔德 1, 阿努·托马斯 1, 宗成昌 1, 约书亚·T·门德尔 1 4 5 6
附属公司

PUMILIO，而不是RBMX，结合是通过非编码RNA调节基因组稳定性所必需的诺拉德

马哈茂德·埃尔金迪等。 埃利夫. .

摘要

诺拉德是一种保守的长非编码RNA（lncRNA），是哺乳动物基因组稳定性所必需的。诺拉德作为细胞质中PUMILIO（PUM）蛋白的负调控因子，我们之前已经证明诺拉德或PUM过度活跃会导致小鼠基因组不稳定和过早衰老（Kopp等人，2019年）。然而，最近有报道称诺拉德通过与细胞核中RNA结合蛋白RBMX的相互作用调节基因组稳定性。在这里，我们讨论了诺拉德：PUM和诺拉德：RBMX与人类细胞中这种lncRNA维持基因组的相互作用。大量RNA FISH和分馏实验证明诺拉德主要定位于细胞质，有或没有DNA损伤。此外，基因拯救实验表明，PUM结合是维持基因组稳定性所必需的诺拉德而RBMX的绑定对于该功能来说是不必要的。这些数据为进一步的机械解剖诺拉德-PUMILIO轴在基因组维护中的作用。

关键词：NORAD；普米利奥；RBMX；染色体；基因表达；遗传学；基因组稳定性；基因组学；人；lncRNA；长的非编码RNA。

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数字

图1。
图1。。诺拉德主要定位于细胞质。
(A类)HCT116细胞中的RNA FISH使用11个探针拼接整个诺拉德转录本显示了一种主要的细胞质信号，这种信号在诺拉德–/–除探针7外，其他所有探针的细胞都会产生非特异性信号，这可能是由于存在Alu重复序列。诺拉德红色为FISH信号，蓝色为DAPI复染。PRE的位置用箭头表示。ND1-ND5表示重复诺拉德如前所述（Lee等人，2016）。(B类)使用探针3的RNA FISH图像显示了更宽的细胞视野。(C类)使用位于HCT116细胞3′端或5′端的引物进行亚细胞分离，然后进行qRT-PCR诺拉德，英寸GAPDH公司（细胞质控制），或NEAT1公司（核控制）。n=3个生物重复，每个重复3个技术重复。
图2。
图2。。诺拉德用DNA损伤剂处理后主要留在细胞质中。
(A类)HCT116细胞中的RNA FISH诺拉德阿霉素或喜树碱治疗12小时后的探针。(B类)诺拉德RNA FISH（探针5）在指定的药物治疗后。使用相同的显微镜设置拍摄的图像。(C–D类)喜树碱处理后HCT116细胞亚细胞分离及qRT-PCR研究(C类)或喜树碱加放线菌素D(D类)在指定的小时数内。n=3个生物重复，每个重复3个技术重复。ns，不显著*p＜0.05**p<0.01***p<0.001；单尾t检验将每个样本与0小时时间点进行比较。
图2——图补充1。
图2-图补充1。。诺拉德阿霉素诱导的DNA损伤后仍以细胞质为主。
(A–B)免疫荧光(A类)或western blot(B类)分析HCT116细胞经阿霉素（1μM）或喜树碱（200 nM）处理12小时后的DNA损伤标记物γ-H2AX(C–D类)阿霉素处理后HCT116细胞亚细胞分离及qRT-PCR研究(C类)或阿霉素加放线菌素D(D类)在指定的小时数内。n=3个生物重复，每个重复3个技术重复。ns，不显著*p<0.05**p<0.01；单尾t检验将每个样本与0小时时间点进行比较。
图3。
图3.生成和稳定表达诺拉德构造。
(A类)描述野生型或突变型的示意图诺拉德构造。诺拉德哺乳动物的序列保护（UCSC Genome Browser Hg38 PhastCons跟踪）突出了以下区域的强烈保护诺拉德窝藏PRE（箭头）。PREmut在PRE（灰色箭头）中包含18个UGU到ACA突变；5′缺失（5′del）缺乏RBMX结合位点（nt 1–898）（Munschauer等人，2018）；5′片段跨越RBMX结合位点（nt 33–898）；ND4构造代表了诺拉德（第2494-3156页）。(B类)将构件插入AAVS1/PPP1R12C使用TALENs的基因座。(C类)每个基因表达的qRT-PCR分析诺拉德HCT116 CRISPRi细胞感染对照组或内源性诺拉德-靶向sgRNAs。表达被归一化为内源性诺拉德级别，由中的表达式表示AAVS1型-感染sgControl的GFP细胞（复制1个标准化的sgControl样本AAVS1型-GFP复制1；复制2个标准化到sgControl的样本AAVS1型-GFP复制品2）。左图中的数据是用ND4中的一对引物生成的，该引物不会扩增5′片段，而右图中的引物位于诺拉德5′端。副本表示两个独立派生的AAVS1型敲除和sgRNA感染细胞系。值规格化为GAPDH公司表达式。n=每个样品3个技术副本。
图3——图补充1。
图3-图补充1.重新分析诺拉德RAP-MS数据。
对之前发布的内容的分析诺拉德RAP-MS数据（Munschauer等人，2018）使用组合的三搜索引擎算法（MS Amanda、Sequest HT、Mascot）将PUM1（绿色）、PUM2（红色）和RBMX（蓝色）的亚型鉴定为显著富集诺拉德互动者。火山图显示了与对照相比的平均褶皱变化风险管理建议两个生物复制的下拉和意义。
图4。
图4.RNA免疫沉淀和定位诺拉德构造。
(A类)使用UV交联和RNA免疫沉淀（RIP）评估PUM1、PUM2和RBMX与GFP mRNA或诺拉德构造。在将指定的构造敲入AAVS1型HCT116 CRISPRi细胞内源性基因座诺拉德用慢病毒表达的sgRNA沉默。qRT-PCR用于评估诺拉德或GAPDH公司每个RIP样品中的回收率，表示为IgG下拉富集。左图中的数据是使用ND4中的一对引物生成的，该引物不会扩增5′片段，而右图使用的引物位于诺拉德5′端。n=2个生物重复，每个重复用三个技术重复进行测量。(B类)野生型或突变型的代表性RNA FISH图像诺拉德由AAVS1型内源性基因敲除后HCT116 CRISPRi细胞中的基因座诺拉德。探头10用于全长诺拉德、PREmut和5′del构造；探针1用于5′frag；而探针6用于ND4。
图4——图补充1。
图4补充1。RIP实验中PUM1、PUM2和RBMX的代表性蛋白质印迹。
PUM1在HCT116中以双链的形式迁移，可能表明翻译后修饰或选择性剪接。我们通过siRNA敲除实验（数据未显示）证实了这两条带代表PUM1蛋白。
图5。
图5..PUMILIO，但不是RBMX，绑定到诺拉德是基因组稳定所必需的。
(A类)第7号染色体（绿色）和第20号染色体（红色）的代表性DNA FISH图像，显示了具有模式（2 n）和非模式（2n±1）染色体数的细胞示例。箭头表示染色体增减。(B类)HCT116 CRISPRi细胞稳定表达AAVS1型敲入结构被表达对照或内源性慢病毒感染诺拉德-靶向sgRNA。18-21天后，使用DNA FISH对7号和20号染色体进行非整倍性分析，并对显示非模态（2n）染色体数的间期细胞的频率进行评分。副本表示两个独立派生的AAVS1型敲除和sgRNA感染细胞系。每个样本对200个细胞核进行评分。虚线表示sgControl感染细胞中观察到的最高水平的背景非整倍体。ns，不显著*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001，chi-square检验比较sg诺拉德每个复制的sgControl。(C类)DAPI染色的HCT116 CRISPRi细胞中染色体分离正常或异常（箭头）的后期细胞的代表性图像。(D类)在每个细胞群的两个生物复制品中测定了有丝分裂细胞出现染色体分离缺陷的频率（每个样品检测100个后期细胞）。虚线表示sgControl感染细胞中观察到的染色体分离缺陷百分比最高。ns，不显著*p＜0.05**p＜0.01***p<0.001****p<0.0001，chi-square检验比较所有sg诺拉德复制1个样本到sgControl GFP复制1和所有sg诺拉德将2个样本复制到sgControl GFP复制品2。
图6。
图6.RBMX不需要用于诺拉德表达或定位。
(A类)qRT-PCR分析RBMX公司和诺拉德HCT116 CRISPRi细胞在引入指示慢病毒表达的sgRNA后的转录水平，包括或不包括阿霉素治疗（1μM，24小时）。量化与GAPDH公司.n=3个技术副本。(B类)亚细胞分离和qRT-PCR诺拉德,GAPDH公司（细胞质控制），或NEAT1公司（核控制）引入控制或RBMX公司-靶向sgRNA。n=3个生物重复，每个重复3个技术重复。
作者回复图片1。
作者回复图片1.RBMX和TOP1的共免疫沉淀诺拉德野生型和敲除细胞。
FLAG标记的RBMX在HCT116细胞中稳定表达，并使用与Munschauer等人，2018中所述相同的条件进行免疫沉淀。
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