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.2019年6月6日；74（5）：966-981.e18。
doi:10.1016/j.molcel.2019.04.012。 Epub 2019年5月8日。

人Pumilio蛋白与RNA结合的定量预测模型

英加陨石 1, 莎拉·丹尼 2, Pavanapuresan P Vaidyanathan公司 1, 温斯顿·R·贝克尔 三, 约翰·O·L·安德烈亚松 4, 柯蒂斯·J·莱顿 4, 卡利·卡佩尔 三, 瓦伦·希瓦申卡尔 5, 拉希·斯列尼瓦桑 1, Rhiju Das公司 1, 威廉·格林利夫 6, 丹尼尔·赫施拉格 7
附属公司

人Pumilio蛋白与RNA结合的定量预测模型

英加陨石等。 分子电池. .

摘要

高通量方法已经实现了RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶集和序列基序的常规生成。然而，需要定量方法来捕捉负责细胞调控的RNA-RBP相互作用的景观。我们使用RNA-MaP平台直接测量数千个设计RNA的平衡结合，并构建人类Pumilio蛋白PUM1和PUM2识别RNA的预测模型。尽管之前发现了线性序列基序，但我们的测量结果显示了广泛的残基翻转和位置耦合。将我们的热力学模型应用于公布的体内交联数据，揭示了预测亲和力和体内占有率之间的定量一致性。我们的分析表明，热力学驱动的持续Pumilio-binding景观受RNA结构或动力学因素（如核糖体置换）的影响很小。这项工作为剖析RBP的细胞行为和影响其占用率的细胞特征提供了定量基础。

关键词：PUF蛋白；普米利奥；RNA结合蛋白；eCLIP；高通量生物物理；转录后调控；热力学。

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数字

图1。
图1.RNA与PUM2结合的定量高通量测量
（A） 上图：人PUM2 RNA结合域的晶体结构与UGUAAAUA RNA结合（PDB:3Q0Q；Lu和Hall，2011). 为了简单起见，八个RNA-结合位点（R1–R8）为按结合RNA残基的5′至3′顺序编号，反之蛋白质一级序列的顺序。中心：代表性PUM2序列motif（基于Hafner等人，2010）。底部：特定碱中PUM2残留物的示意图相互作用（Wang等人，2002）。（B） 用于研究RNA序列特异性的支架。黄色圆圈指示可变区域（见图S1B）。（C） 左图：RNA-MaP实验示意图（Buenrostro等人，2014）。正确的：RNA簇子集经培养后的代表性图像PUM2浓度增加。58.4 nM的星号表示调整后的对比度相对于其他图像，由于背景荧光增强。（D） 共识序列的代表性结合曲线（UGUAUA，S2b支架）和突变序列（UGUAGCGC公司、S1a脚手架）。包含指示序列的簇的数量（n）为注意。圆圈表示蛋白质通道中的荧光由RNA通道中的荧光。中位数和95%置信区间（CI）跨集群显示。蓝线表示适合装订模型，其中包括PUM2与PUM2-RNA结合的非特定术语复杂，灰色区域表示拟合的95%置信区间(K（K）D类（一致）=0.17 nM，CI95%=(0.10; 0.35);K（K）D类（突变型）>340 nM，对应于结合亲和力的上限自信地与背景区分开来）。（E） 对两种不同流程进行技术复制的比较细胞。每个实验中至少有五个聚类且具有ΔG误差的数据显示小于1 kcal/mol（95%CI）。透明瓷砖对应于ΔG值大于可与背景可靠区分的值（STAR方法）；n对应于数字高置信亲和力范围内的变体的总数用括号表示。黑色虚线表示斜率为1红线被重复1和2之间的平均差值（0.32）所抵消kcal/mol），说明蛋白质活性和/或稀释。RMSE值是在考虑该偏移后计算的（RMSE=0.42 kcal/mol，不考虑偏移量）。另请参见图第1章。
图2。
图2与PUM2结合的单突变变异体分析
（A） 顶部：图1B中脚手架的颜色代码；箭头指向每个位置1的相关性序列变量。底部：K（K）D类PUM2值UGUAUAUA共识每个位置的单个突变体。横线表示两次重复测量的加权平均值，误差条表示加权复制错误。虚线表示四个支架上的一致序列，一致残差为圈出。星号表示变量之间存在显著差异脚手架（10%FDR）。（B） RNA继发性解释前后的支架差异结构和排除具有预测结构的序列后。酒吧指出每种差异分布的标准偏差测量值（部分A类)脚手架意味着各自的序列变量；另请参见图S2A和STAR方法。虚线表示标准测量误差偏差。实验标准偏差较高37°C时比25°C时，因为结合力较弱且缺乏独立重复实验。（C） PUM2结合的RNA结构效应模型。封闭RNA分子通过以下方式增加观察到的离解常数（减弱结合）稳定未结合状态（另请参见图S2B和STAR方法）。（D） 考虑结构效应后的单突变亲和力通过RNAfold预测（实心条；Lorenz等人。，2011); 透明区域表示结构修正。错误条表示加权复制错误。星号表示带有考虑结构影响后，支架差异显著。（E） 每个单一突变（残基1-8）的中位数效应脚手架和跨5A/C/U背景，25°C，不包括变体使用可选的绑定寄存器并在计算结构之后。错误条形表示中位数的95%CI。计算突变效应的相对值与支架上UGUA[A/C/U]AUA共识的加权平均亲和力。位置9特异性如图S2F所示计算相对于最紧密结合的残基（G）的效应。（F） 通过RNA-MaP（图2E）和凝胶位移测量的单突变亲和力的比较。1C，紫色；2安培，黄色的；2C，绿色；3A，白色；3G，红色；4G，橙色；4U，蓝色；5G，小麦；7C中，棕色；7G，洋红；9A，石灰；9C，青色；9U，灰色。gel-shift值为两到四次测量的平均值和95%CI。另请参见图S2和S3。
图3。
图3.PUM2特异性预测模型的开发
（A） 顶部：添加剂连续的示意图和测试模型。b是束缚碱基的位置，X是位置b处的碱基。ΔΔG公司b条x个值对应于测量的单个25°C下的突变惩罚（图2E；表S2）。底部：相对预测值与观测值ΔΔG中所有非结构化变体的UGUAUAU共识序列图书馆。预测的ΔΔG值说明了所有沿着RNA序列的可能寄存器（STAR方法）。透明符号表示变量绑定更弱高于高置信亲和力测定阈值；这些变体被排除在确定R之外2和RMSE值以及来自全球零件E和F中的配件。根据与预测亲和力除以测量不确定度(z（z）=|ΔG公司光突发事件−ΔG公司pred（前）|/σΔG公司; 在z=3处设置上限以进行可视化）。黑人虚线是单位线，灰色虚线表示1 kcal/mol与预测值的偏差。（B） 用于基本滑动分析的C插入库。（C） 使绑定比预期更紧密的插入示例通过加性连续结合模型，并为碱基提供证据翻转。X表示不匹配。ΔΔGpred（前）对应加性连续模型的预测（图3A）。翻转时，ΔΔGpred（前）表示仅占绑定位置的预测，该预测值为0共识残留物在每个位点。（D） 每个ΔΔG观测值和预测值汇总B部分C插入的位置。绿色框表示观测到的ΔΔG值小于预测值，表明基本值翻转。箭头表示观察到的亲和力是基的下限投掷罚球。包含以下内容的库变体的平均值和标准错误具有指示插入且缺乏稳定的一致序列显示了替代寄存器（表S3）。（E） 可加非连续模型。Y表示翻转的残留物位置f。翻转残留物的编号基于侧面边界残留物；3/4–6/7. 橙色虚线轮廓表示残差耦合异常值。（F） 最终模型包括绑定、翻转和耦合项。c（c）表示耦合残数的位置，Z是耦合残数残留物。表1提供了最终模型参数。另请参见图S4–S6以及表S2、S3、S4和S5。
图4。
图4.PUM2绑定的热力学模型，集成绑定模式和寄存器
（A） 长度为n的RNA序列可以绑定在一系列9到11-mer寄存器（r），其中RNA残基的分布是可变的在绑定和翻转位置之间。绑定寄存器的代表子集并且示出了包括在模型：连续、1-nt和2-nt翻转（在单个位置）和两个在不同位置翻转。这些方程表示预测值的积分所有可能结合位点的ΔΔG值，以获得最终密切关系。预测单个结合位点的ΔΔG值配置如表1所示。ΔG重量是一致序列的亲和力。（B） PUM2占用率预测模型示意图mRNA靶点（见STAR方法）。
图5。
图5 PUM2与野生型和工程PUM1蛋白的RNA-结合特异性比较
（A） 整个文库中PUM1和PUM2亲和力之间的相关性。红线的斜率为1，偏移量为1.07 kcal/mol，对应于PUM1与PUM2的结合较弱；RMSE值是在计算常量偏移量。（B） 使用基于PUM2的模型预测PUM1绑定。插图显示了预测值偏差的分布。（C） 重复序列中单个氨基酸变化的示意图工程PUM1的“R6”。（D） 野生型单个突变体特异性的差异和突变PUM1。单个突变惩罚加权平均数的差异显示了UGUAUAUA背景中的跨支架，以及误差条表示传播的加权误差。N.A.表示缺乏可检测的结合突变PUM1。（E） 预测突变PUM1亲和力（基于PUM2模型）与观察到的亲和力；ΔΔG值相对于UGUAUAU共识。尽管对大多数变体进行了准确预测，但18%的变体偏离>1 kcal/mol，与突变的特异性改变一致PUM1。（F）预测与观察到的突变型PUM1与改变的6U罚款。
图6。
图6.测试热力学模型在体内
（A） 与eCLIP富集相比的热力学亲和力预测K562细胞（Van Nostrand等人，2016年）。预测相对值范围内各站点eCLIP富集中值图中显示了相似性，误差条表示中位数上95%的CI。仅网站由于以下原因，显示了缺乏相邻的含UGUA的场地（100 nt以内）在附近位点存在的情况下观察到eCLIP信号的膨胀（图S7A）。黑色虚线行表示eCLIP信号的预测变化随预测值的增加而增加ΔΔG值，相对于最低值的eCLIP信号ΔΔG bin.eCLIP（闭合圈）和输入（开放圈）对应于使用或未使用抗PUM2处理的交联样品抗体（Van Nostrand等人。，2016). 灰色虚线表示站点的eCLIP浓缩预测ΔΔG值大于4.5 kcal/mol（表示成绩单）；因为eCLIP信号和输入都标准化为该值，这个预期的富集度等于1。每个垃圾箱的站点数量从97个不等至14787，并在表S6中提供。（B） eCLIP富集中位数和95%CIΔΔG，使用全热力学模型（左）或模型这没有考虑翻转残留物（右）。只有在的箱子显示了至少25个站点。（C） 3′UTR内位点的eCLIP富集比较K562细胞中表达基因的（橙色）或CDS（灰色）区域。中位数和95%显示CI。黑线和灰线如A所示。（D）注释为3′UTR、CDS或5′的位点部分预测ΔΔG值范围内的UTR。（E） 与给定注释（5′UTR、CDS和3′UTR）与预期注释分数（基于随机选择的站点）。（F） 跨预测箱的共识站点的eCLIP富集中值阻止PUM2共识站点的结构的二级结构稳定性（图2C：STAR方法）。颜色表示侧翼数量稳定性计算中包括核苷酸（nt）。虚线表示二级结构增加时eCLIP信号的预测变化37°C下的稳定性。至少有20个站点的垃圾箱的中位数和95%CI如图所示。（G） 3′的热力学占用率预测示例人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1b的UTR区CDKN1B型人类Pumilio蛋白的已知靶点mRNA（Kedde等人，2010年）。左轴表示与UGUAUAU相关的预计相对占用率共识；右轴表示预测的部分占用率（即。，束缚分数与总分数CDKN1B型mRNA）核算后细胞PUM2和RNA丰度（参见STAR方法）。（H） 人类转录组PUM2结合景观预测我们的热力学模型使用体内PUM2和mRNA水平（参见STAR方法）。横线表示穿过RNA结合位点的结合PUM2分子数，0到8个无翻转残基（蓝色）或最多有两个翻转残基的非感官残基残留物（绿色）。共识被定义为UGUA[ACU]AUAN。有关的数量，请参见表S6每种类型的站点。另请参见图S7和表第6章。
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    Ishigami Y、Wong MS、Martí-Gómez C、Ayaz A、Kooshkbaghi M、Hanson SM、McCandlish DM、Krainer AR、Kinney JB。 Ishigami Y等人。 国家公社。2024年2月29日；15(1):1880. doi:10.1038/s41467-024-46090-5。 国家公社。2024 PMID：38424098 免费PMC文章。
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    Wang J、Zhang Y、ZhangT、Tan WT、Lambert F、Darmawan J、Huber R、Wan Y。 王杰等。 自然方法。2024年3月；21(3):411-422. doi:10.1038/s41592-023-02128-y.电子出版2024年1月4日。 自然方法。2024 PMID：38177506 免费PMC文章。
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    1. Becker WR、Jarmoskaite I、Kappel K、Vaidyanathan PP、Denny SK、Das R、Greenleaf WJ和Herschlag D（2019a）。通过RNA/蛋白质结合对普遍存在的RNA二级结构预测算法进行定量高通量测试。生物Rxiv。10.1101/571588.-内政部
    1. Becker WR、Jarmoskaite I、Vaidyanathan PP、Greenleaf WJ和Herschlag D（2019b）。使用人蛋白PUM2证明由RNA结构介导的蛋白质协同性。RNA 118，10.1261/RNA.068585.118。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Berg JM和Stryer L（2002年）。《生物化学》，第5版（W H Freeman；）。
    1. Bohn JA、Van Etten JL、Schagat TL、Bowman BM、McEachin RC、Freddolino PL和Goldstrohm AC（2018年）。鉴定受人类Pumilio蛋白功能调节的多种靶RNA。核酸研究46，362–386。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Buenrostro JD、Araya CL、Chircus LM、Layton CJ、Chang HY、Snyder MP和Greenleaf WJ（2014）。大规模平行阵列上RNA-蛋白质相互作用的定量分析揭示了生物物理和进化景观。《国家生物技术》32、562–568。-项目管理咨询公司-公共医学

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