Ceramides bind VDAC2 to trigger mitochondrial apoptosis

doi:10.1038/s41467-019-09654-4

.2019年4月23日；10(1):1832.

doi:10.1038/s41467-019-09654-4。

神经酰胺结合VDAC2触发线粒体凋亡

附属公司

¹德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系分子细胞生物学部，49076。
²德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系分子细胞生物学部，49076。j.mina@tees.ac.uk。
^三英国TS1 3BX米德尔斯堡蒂赛德大学科学、工程与设计学院。j.mina@tees.ac.uk。
⁴埃及开罗Ain Shams大学环境研究所。
⁵路易斯安那州新里斯本大学Química e Biológica António Xavier技术研究所。葡萄牙奥埃拉斯，达Repüblica，2780-157。
⁶巴西佛罗里达州圣卡塔里纳联邦大学生物科学中心生物科学部。
⁷奥斯纳布吕克大学生物/化学系植物生理学系，49076，德国奥斯纳布吕克。
⁸奥斯纳布吕克大学细胞纳米分析中心，Artilleriestra坨e 77，49076，Osnabrück，Germany。
⁹分子微生物学和免疫学，俄勒冈州波特兰市俄勒冈山健康与科学大学，邮编97239，美国。
¹⁰格罗宁根大学格罗宁恩生物分子科学与生物技术研究所和泽尼克先进材料研究所，荷兰格罗宁安，尼詹堡7，9747 AG。
¹¹路易斯安那州新里斯本大学Química e Biológica António Xavier技术研究所。da República，2780-157，葡萄牙Oeiras。m.n.melo@itqb.unl.pt。
¹²格罗宁根大学格罗宁恩生物分子科学与生物技术研究所和泽尼克先进材料研究所，荷兰格罗宁安，尼詹堡7，9747 AG。m.n.melo@itqb.unl.pt。
¹³德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系分子细胞生物学部，49076。holthuis@uos.de。
¹⁴奥斯纳布吕克大学细胞纳米分析中心，Artilleriestra坨e 77，49076，Osnabrück，Germany。holthuis@uos.de。
¹⁵膜生物化学和生物物理，荷兰乌得勒支3584 CH乌得勒支特大学Bijvoet中心和生物膜研究所。holthuis@uos.de。

PMID： 31015432
预防性维修识别码： PMC6478893型
内政部： 10.1038/s41467-019-09654-4

神经酰胺结合VDAC2触发线粒体凋亡

沙申克·达德塞纳等。国家通讯社. 2019.

.2019年4月23日；10(1):1832.

doi:10.1038/s41467-019-09654-4。

附属公司

¹德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系分子细胞生物学部，49076。
²德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系分子细胞生物学部，49076。j.mina@tees.ac.uk。
^三英国TS1 3BX米德尔斯堡蒂赛德大学科学、工程与设计学院。j.mina@tees.ac.uk。
⁴埃及开罗Ain Shams大学环境研究所。
⁵路易斯安那州新里斯本大学Química e Biológica António Xavier技术研究所。葡萄牙奥埃拉斯，达Repüblica，2780-157。
⁶巴西佛罗里达州圣卡塔琳娜联邦大学生物技术中心生物技术部。
⁷奥斯纳布吕克大学生物/化学系植物生理学系，49076，Osnabrück，德国。
⁸奥斯纳布吕克大学细胞纳米分析中心，Artilleriestra坨e 77，49076，Osnabrück，Germany。
⁹分子微生物学和免疫学，俄勒冈州波特兰市俄勒冈山健康与科学大学，邮编97239，美国。
¹⁰格罗宁根大学格罗宁恩生物分子科学与生物技术研究所和泽尼克先进材料研究所，荷兰格罗宁安，尼詹堡7，9747 AG。
¹¹魁北克生物技术研究所António Xavier，意大利新葡京大学。葡萄牙奥埃拉斯，达Repüblica，2780-157。m.n.melo@itqb.unl.pt。
¹²格罗宁根大学格罗宁恩生物分子科学与生物技术研究所和泽尼克先进材料研究所，荷兰格罗宁安，尼詹堡7，9747 AG。m.n.melo@itqb.unl.pt。
¹³德国奥斯纳布吕克大学生物/化学系分子细胞生物学部，49076。holthuis@uos.de。
¹⁴奥斯纳布吕克大学细胞纳米分析中心，Artilleriestra坨e 77，49076，Osnabrück，Germany。holthuis@uos.de。
¹⁵膜生物化学和生物物理，荷兰乌得勒支3584 CH乌得勒支特大学Bijvoet中心和生物膜研究所。holthuis@uos.de。

PMID： 31015432
预防性维修识别码： PMC6478893型
内政部： 10.1038/s41467-019-09654-4

摘要

神经酰胺作为肿瘤抑制脂质，直接作用于线粒体，引发凋亡细胞死亡，引起广泛关注。然而，其潜在机制的分子细节在很大程度上尚不清楚。使用可光活化的神经酰胺探针，我们在此确定电压依赖性阴离子通道VDAC1和VDAC2为线粒体神经酰胺结合蛋白。粗颗粒分子动力学模拟显示，两个通道在桶壁的一侧都有神经酰胺结合位点。该部位包括一种膜埋谷氨酸，介导与神经酰胺头部组的直接接触。这种残留物的取代或化学修饰消除了用神经酰胺探针对两个通道进行的光标记。与去除VDAC1不同，VDAC2的缺失或用谷氨酰胺取代其膜面谷氨酸使人结肠癌细胞对神经酰胺诱导的凋亡产生很大的抵抗力。总之，我们的数据支持VDAC2作为神经酰胺介导的细胞死亡的直接效应器的作用，为神经酰胺如何发挥其抗肿瘤活性提供了分子框架。

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图1
线粒体神经酰胺结合蛋白的化学筛选产生VDAC1和-2。一光活性和可点击C的结构₁₅-神经酰胺类似物，pacCer。b条从HeLa细胞分离的线粒体与含有越来越多pacCer的脂质体孵育，紫外线照射，然后与AF647-N点击反应_三对样品进行SDS-PAGE处理，进行凝胶内荧光（IGF，红色），并用考马斯蓝（CB，蓝色）染色。p33•Cer表示33kDa的显著光标记蛋白带。**c（c）**p33•Cer识别策略。d日p33•Cer是使用NeutraAvidin-bads从pacCer标记的和TAMRA/生物素点击反应的线粒体中纯化出来的，通过IGF成像，从凝胶中切除，通过胰蛋白酶消化，然后通过LC-MS/MS鉴定。两个独立实验的数据表明，p33•Cer对应于VDAC1和VDAC2。**e（电子）**通过从用非沉默（siNS）或VDAC靶向siRNA（siVDAC1，siVDAC2）处理的HeLa细胞中分离的线粒体的免疫印迹来验证抗VDAC抗体的特异性。请注意，抗VDAC3抗体与VDAC2交叉反应。**（f）**从siVDAC1/2处理的HeLa细胞中分离的线粒体用pacCer进行光标记，用AF647-N进行点击反应_三进行IGF分析，然后进行CB染色。克对p33•Cer亲和纯化过程中获得的组分进行SDS-PAGE，转移到硝化纤维素上，通过on-blot-fluscence（OBF）分析，并用VDAC1、TOM40和p60-Mito抗体进行检测。小时在p33•Cer的亲和纯化过程中获得的级分按照克并用抗VDAC2和抗VDAC3抗体进行检测。T总线粒体提取物、FT流通、W洗涤、E洗脱液

图2
MD模拟揭示了VDAC1和-2上可能的神经酰胺结合位点。一在含有5 mol%神经酰胺的OMM模型中，小鼠VDAC1、VDAC2和VDAC3的神经酰胺头部组接触占用率，1.0对应于整个模拟时间内的神经酰胺接触。蓝色虚线表示基于非结合性场地残留物占用率的15%占用率阈值。VDAC1和VDAC2具有明确的神经酰胺结合位点，包括残基58-62、71-75和81-85；VDAC3中缺少此站点。b条序列比对揭示了VDAC1（E73）和VDAC2（E84）中双层堆砌Glu残基的位置，该残基在VDAC3（Q73）中被Gln取代。**c（c）**来自MD模拟的静像，显示了神经酰胺分子与VDAC1的接近和结合，在其脱质子化状态下紧邻双层谷氨酸残基。蛋白质表面颜色标记极性（绿色）、非极性（白色）、阳离子（蓝色）或阴离子（红色）残留物。d日VDAC1、VDAC1的空间填充和线框模型^E73Q系列、VDAC2和VDAC2^E84Q公司用去质子的E73/E84。所示为神经酰胺占用率大于10%（橙色）或胆固醇占用率大于20%（黄色）的体积。**e（电子）**神经酰胺与VDAC1、VDAC1接触时间的分布^E73Q系列、VDAC2和VDAC2^e84克在首选的结合部位，如d日. The年-axis表示在绑定事件中花费的总系统时间所占的比例，其持续时间由x个.汇总所有点年-值产生了神经酰胺结合时总模拟时间的分数

图3
VDAC与神经酰胺的结合依赖于双层谷氨酸的质子化状态。一VDAC1和VDAC2的空间填充和线框模型用质子化或去质子化状态下的双层表面Glu残基进行模拟。所示为神经酰胺占用率大于10%（橙色）或胆固醇占用率大于20%（黄色）的体积。b条神经酰胺与VDAC1和VDAC2在优选结合位点接触的持续时间分布，如一. The年-axis表示在绑定事件中花费的总系统时间所占的比例，其持续时间由x个.汇总所有点年-值产生了神经酰胺结合时总模拟时间的分数。**c（c）**人类VDAC1和VDAC1^E73Q系列生产于*大肠杆菌*，纯化，在脂质体中重组，然后在指示的pH值下用从乙醇原料中添加的pacCer进行光标记。使用AF647-N点击重显样本_三SDS-PAGE，IGF和CB染色分析。d日重组VDAC1的相对pacCer光标记效率的定量分析**c（c）**数据为平均值±标准差。；n个 = 4; **第页 < 0.01双尾配对t吨-测试。源数据

图4
双层涂层Glu是VDAC的pacCer光标记的关键决定因素。一人类VDAC1，VDAC1^E73Q系列、VDAC2和VDAC2^E84Q公司生产于*大肠杆菌*，纯化，在脂质体中重组，并在37°C下与含有1 mol%pacCer的脂质体或二酰甘油（pacDAG）、磷脂酰胆碱（pacPC）、磷脂酰基乙醇胺（pacPE）或胆固醇（pacChol）的光活性和可点击类似物孵育30分钟。样品经过紫外线照射，然后用AF647-N点击再反应_三SDS-PAGE，IGF和CB染色分析。b条重组VDAC1、VDAC1相对标记效率的定量分析^E73Q系列、VDAC2和VDAC2^E84Q公司含有如中所示的pacLipid一数据为平均值±标准差。；n个 ≥ 3.来源数据

图5
C对VDAC的pacCer光标记的竞争性抑制₁₆-神经酰胺。一VDAC1、VDAC1^E73Q系列、VDAC2和VDAC1^E84Q公司用从乙醇储备中添加的指定量的pacCer或pacChol对蛋白质脂质体进行光标记。接下来，用AF647-N点击重新反应样本_三SDS-PAGE，IGF和CB染色分析。b条VDAC1、VDAC1^E73Q系列、VDAC2和VDAC1^E84Q公司蛋白质脂质体用0.2 nmol pacCer或pacChol在指示量的天然C存在下进行光标记₁₆-从乙醇原料中添加神经酰胺（Cer），然后按照一相对标记效率被量化，并表示为对照组的%（0.2 nmol pacCer或无Cer的pacChol）。数据为平均值±标准差。；n个 = 3; *第页 < 0.05, **第页 < 0.01，以及***第页 < 0.001（双尾配对）t吨-测试。源数据

图6
VDAC2的去除破坏了神经酰胺诱导的细胞凋亡。一神经酰胺转移蛋白CERT、mitoCERT和mitoCERTΔSTART的示意图。MitoCERT是通过将CERT的Golgi靶向pleckstrin同源结构域与AKAP1的OMM锚交换而创建的。去除神经酰胺转移或START结构域产生丝裂原ΔSTART。所有三种蛋白质都通过其FFAT基序（F）与ER受体蛋白VAP-A结合。铈神经酰胺、PI（4）P磷脂酰肌醇-4-磷酸、TGN反式-高尔基网络。b条神经酰胺（Cer）是通过在内质网细胞溶质表面上的神经酰胺合成酶（CerS）对长链碱（LCB）进行N-酰化合成的，需要CERT介导转移到高尔基体，以便通过高尔基体SM合酶（SMS）代谢转化为鞘磷脂（SM）。mitoCERT的表达导致生物合成神经酰胺流向线粒体，触发Bax依赖性凋亡。**c（c）**用空载体（EV）、标记的mitoCERT或标记的mito CERTΔSTART转染人结肠癌HCT116细胞的野生型（WT）、VDAC1-KO（ΔVDAC1）、VDAC 2-KO（△VDAC1。转染后24小时，用针对PARP1、Flag表位、VDAC1、VDAC2和β-肌动蛋白的抗体对细胞进行免疫印迹处理。定量PARP1裂解的百分比。数据为平均值±标准差。；n个 = 3; *第页 < 0.05和**第页 < 0.01双尾配对t吨-测试。源数据

图7
神经酰胺诱导的凋亡严重依赖VDAC2中的Glu84。一用HA标记的VDAC1、VDAC1稳定转导WT和ΔVDAC1/2 HCT116细胞^E73Q系列、VDAC2或VDAC2^E84Q公司用空载体（EV）、标记的mitoCERT或标记的mitoSTARTΔSTART转染。转染后24小时，用抗PARP1、裂解caspase-3（Casp3）、Flag-epitope、HA-epitoper和β-actin抗体对细胞进行免疫印迹。FL全长，CL劈开。b条细胞中PARP1裂解的定量分析一数据为平均值±标准差。；n个 = 4; *第页 < 0.05, **第页 < 0.01和***第页 < 0.001（双尾配对）t吨-测试。**c（c）**细胞裂解Casp3的定量分析一数据为平均值±标准偏差。；n个 = 2.源数据

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中的注释

揭示神经酰胺导致细胞死亡的分子原理。
Dadsena S、Hassan DG、Holthuis JCM。 Dadsena S等人。细胞应激。2019年7月16日；3(8):280-283. doi:10.15698/cst2019.08.196。细胞压力。2019 PMID：31440742 免费PMC文章。

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1. Holthuis JC、Pomorski T、Raggers RJ、Sprong H、Van Meer G.鞘磷脂在细胞内膜转运中的组织潜力。生理学。2001年修订版；81:1689–1723. doi:10.1152/physrev.2001.81.41689。-内政部-公共医学
1. Carreira AC、Ventura AE、Valera AR、Silva LC。处理鞘脂的生物物理特性以解读其生物作用。生物化学。2015;396:597–609. doi:10.1515/hsz-2014-0283。-内政部-公共医学
1. Morad SAF，Cabot MC。癌细胞中的神经酰胺协调信号。Nat.Rev.癌症。2013;13:51–65. doi:10.1038/nrc3398。-内政部-公共医学
1. Ogretman B.鞘脂代谢在癌症信号转导和治疗中的作用。Nat.Rev.癌症。2018;18:33–50. doi:10.1038/nrc.2017.96。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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