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.2019年3月1:14:536-549。
doi:10.1016/j.omtn.2019.01.002。 Epub 2019年1月10日。

卵巢切除小鼠断奶逆转骨质疏松症和肉瘤坏死症过程中发现的MicroRNA-672-5p

纳西尔·艾哈迈德 1, 普里扬卡·库什瓦哈 1, 阿尼鲁达·卡瓦德 1, 阿希什·库马尔·特里帕蒂 1, 普里扬卡·科塔里 1, 苏莱卡·阿迪卡里 1, 维克拉姆·赫奇卡尔 1, 维贾伊·库马尔·米什拉 1, 特里维迪 2
附属机构

卵巢切除小鼠断奶逆转骨质疏松症和肉瘤坏死症过程中发现的MicroRNA-672-5p

纳西尔·艾哈迈德等。 摩尔热核酸. .

摘要

产后条件加剧了生物衰老过程，其特征是多代谢紊乱，其中骨丢失是最常见的结果，通常伴有肌肉减少。与仅患有骨质疏松症的个体相比，这种相关发病机制的共存会导致更糟糕的健康结果。孕期和哺乳期，出生前和出生后的骨骼发育需要从母亲到胎儿的钙，从而导致母亲骨骼的显著损失。它遵循着断奶前后的合成代谢阶段，在此期间，母体骨骼得到显著恢复。在这里，我们研究了在断奶期间确定的microRNA-672-5p在去卵巢小鼠中主要表达时对骨质减少和肌肉减少的治疗作用。miR-672-5p诱导成骨细胞分化和矿化。这些作用是通过抑制Smurf1和增强Runx2转录激活介导的。在体内，miR-672-5p显著增加了成骨细胞生成和矿化，从而逆转了卵巢切除引起的骨丢失。它还提高了骨密度、承载能力和骨质量。miR-672-5p也能缓解肉芽肿，因为我们观察到肌肉纤维的横截面积和Feret直径增加。我们假设miR-672-5p表达升高对雌激素缺乏诱导的骨量减少和肌肉减少有治疗作用。

关键词：微机断层成像；microRNA-672-5p；骨量减少；肌肉减少；小梁微结构。

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数字

无
图形摘要
图1
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miR-672-5p抑制Smurf1以促进成骨细胞分化（A）miR-672的干环结构，由miR-base预测（成熟的miR-675-5p序列显示为绿色）。（B和C）miR-672-5p在不同组织（B）和细胞中的表达（qPCR，一式三份），即在增殖、分化或矿化过程中的成骨细胞（C）。数据为平均值±标准偏差。与成骨细胞增殖期相比，*p<0.05和***p<0.001。（D–F）用模拟物（miR-672-5p）、抑制剂（抗miR-672-15p）和miR-C（对照）转染成骨细胞对碱性磷酸酶（ALP）活性（OD，n=8）（D）和矿化（OD（n=4）（E）的影响。（F） 成骨细胞培养第15天在成骨培养基中形成茜素阳性集落（Cfu-ob）的代表性微孔。数据为平均值±SE。与miR-C相比，*p<0.05和**p<0.01。（G）鉴定成骨细胞中的miR-672-5p靶基因，并对miR-6725p与Smurf1和（H）的3′UTR的互补性进行计算分析报告质粒的示意图，用于说明Smurf1 3′UTR对荧光素酶活性的影响。巨细胞病毒启动子；Luc，萤光素酶；RLuc，肾素荧光素酶。（一） 分析miR-672-5p过表达对含有Smurf1 3′UTR的双荧光素酶报告质粒的影响。用WT-pEZX-MT06-Smurf1或空载体（NC，阴性对照）和miR-672-5p或miR-C共同转染细胞。在细胞裂解液中测量萤火虫和肾小球荧光素酶。数据是三个独立测量值的平均值±SE**与miR-C相比，p<0.01。（J）Smurf1在成骨细胞增殖、分化或矿化过程中的表达（qPCR，一式三份）。数据为平均值±标准偏差。*与成骨细胞增殖期相比，p<0.05。（K） 用模拟物（miR-672-5p）转染成骨细胞可增强条件培养基中BMP2的释放（BMP2-ELISA）。数据为三个独立实验的平均值±SE*与miR-C相比，p<0.05。（L）使用荧光素酶（Luc）报告子，miR-672-5p或打乱的miR-C对Runx2启动子活性的影响。数据为三个独立实验的平均值±SE*与miR-C相比，p＜0.05。（M）转染48小时后，对Smurf1（miR-672-5p的直接靶基因）或成骨细胞分化基因，包括Runx2、BMP2、Smad1和ALP进行qPCR（一式三份）。数据为平均值±标准偏差。与miR-C相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。转染48小时后，对Smurf1（ab38866-Abcam；1:1000）、Runx2（ab76956-Abcan；1:1000。β-肌动蛋白（sc-47778 Santa Cruz Biotechnology；1:500）作为负荷控制。二级抗体（抗兔或抗鼠；1:10000）是辣根过氧化物酶（HRP）偶联物（Sigma-Aldrich）。（O–S）miR-672-5p抑制Smurf1，促进Runx2的上调和成骨细胞分化。（O） ALP活性（OD，n=8）、（P）Cfu-ob形成、（Q）矿化（OD、n=4）、Runx2、BMP2、Smurf1、ALP和Smad1的（R）mRNA表达（qPCR，一式三份）、Smurf1的（S）蛋白表达在对照成骨细胞或转染抗Smurf1或干扰siRNA（Si-Scr）的siRNA。β-肌动蛋白（sc-47778 Santa Cruz Biotechnology；1:500）作为负荷控制。二级抗体（抗兔或抗鼠；1:10000）是HRP结合的（Sigma-Aldrich）。数据为平均值±标准偏差。与miR-C或对照组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。其他比较，ˆp<0.05，ˆˆp<0.01，以及ˆˆˆp<0.001，如图所示。
图2
图2
miR-672-5p治疗恢复卵巢切除术引起的胫骨小梁骨丢失（A）示意图体内实验装置。（B） 在6周治疗结束时，使用Invivefectamine 3.0试剂向12周龄雌性BALB/c小鼠注射miR-672-5p模拟物后，骨中miR-675-5p表达增强（qPCR，一式三份），这表明组织摄取充足。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，***p<0.001。（C） micro-CT生成的胫骨代表性3D图像。（D）治疗6周后，胫骨的体积骨密度（vBMD）有所改善。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，**p<0.01和***p<0.001，或如图所示ˆˆp<0.01；n≥6只小鼠/组。（E） 骨小梁的结构显微CT参数，包括BV/TV、Tb。Sp、Tb。N、 Tb、。胫骨骨骺中的Pf、SMI和Conn.Dn（单位如图所示）。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，或如图所示ˆˆˆp<0.001；n=每组8只小鼠。股骨和椎骨分别参见图S1和表1。
图3
图3
miR-672-5p治疗具有合成代谢作用并促进骨形成（A）脱钙骨切片中的免疫荧光检测显示，与PBS治疗组相比，miR-675-5p过度表达促进Runx2表达（红色），抑制Smurf1表达（绿色）（n=3，放大20倍）。（B和C）不同组股骨远端Goldner三色（GT）染色（B）的代表性显微照片和组织形态计量学定量；使用Bioquant软件的BS/TV（C）。数据为平均值±标准偏差。*与PBS治疗组相比，p<0.05，或如图所示ˆp<0.05；（n=3，放大20倍）。（D） 成骨标志物；ELISA法检测各组血清P1NP浓度。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，**p<0.01，或如图所示ˆˆˆp<0.001；（n=6）。（E） 股骨钙黄绿素双重标记的代表性显微照片（n=3，放大20倍）。（F） 量化显示矿化表面与骨表面（MS/BS）、矿物并置率（MAR）和骨形成率、表面参照物（BFR/BS）归一化的数据。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，或如图所示ˆˆp<0.01和ˆˆˆp<0.001。股骨干骺端破骨细胞数量和骨吸收表面估计值的组织学检查见图S2A–S2C体内实验。
图4
图4
miR-672-5p治疗抑制蓝1在体内促进成骨细胞生成（A）ALP活性（OD，n=6），（B。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，或如图所示图6p<0.01。蓝精灵1（D）、Runx2（E）和BMP2（F）的mRNA表达（qPCR，一式三份），以及蓝精灵1（ab38866 Abcam；1:1000）、Runx2（ab76956 Abcam；1:1000）和BMP2（ab14933 Abcam；1:1000）在接受PBS（0.2mL）的假手术（sham）或去卵巢（OVx）小鼠的成骨细胞中的蛋白表达（G）（蛋白质印迹），打乱的miR（miR-C，7.0 mg kg−1)，或miR-672-5p（7.0 mg kg−1). β-肌动蛋白（sc-47778 Santa Cruz Biotechnology；1:500）作为负荷控制。二级抗体（抗兔或抗鼠；1:10000）是HRP结合的（Sigma-Aldrich）。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。参见图S2D–S2F在体外microRNA-672-5p对骨髓细胞培养破骨细胞生成的作用。
图5
图5
miR-672-5p治疗缓解卵巢切除术引起的肉瘤（A）体重、（B）瘦体重和（C）血清CK水平。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05和**p<0.01，或如图所示ˆp<0.05，ˆˆp<0.01，以及ˆˆˆp<0.001（每组n≥6只）。（D） 所示各组腓肠肌H&E染色切片的代表性显微照片（n=3，放大40倍）。（E） 横截面积（CSA）和（F）费雷特直径。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，或如图所示ˆˆˆp<0.001。（G和H）层粘连蛋白（G）免疫染色和Atrogin-1（H）免疫染色（n=3，放大40倍）。MyoD（I）、Atrogin-1（J）和MuRF-1（K）的mRNA表达（qPCR，一式三份）和肌肉分化标记物的蛋白表达（L）（western blotting）；来自指定组腓肠肌的MyoD（MA1-41017-Thermo Scientific；1:1000）、分解代谢标记物、atrogin-1（ab74023-Abcam；1:100）和肌环纤维蛋白-1（MuRF-1，ab183094-Abcam，1:1000）。β-肌动蛋白（sc-47778 Santa Cruz Biotechnology；1:500）作为负荷控制。二级抗体（抗兔或抗鼠；1:10000）是HRP结合的（Sigma-Aldrich）。数据为平均值±标准偏差。与PBS治疗组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
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