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.2019年2月21日；4（4）：e124522。
doi:10.1172/jci.insight.124522。

长非编码RNA Malat1调节巨噬细胞的差异激活和对肺损伤的反应

崔华春 1, 萨米·班纳吉 1, 郭思嘉 1 2, 谢娜（Na Xie） 1, 景阁 1 三, 定远江 1 4, 马丁·泽宁 5, 维克托·桑尼科尔 1, 刘刚（Gang Liu） 1
附属公司

长非编码RNA Malat1调节巨噬细胞的差异激活和对肺损伤的反应

崔华春等。 JCI洞察力. .

摘要

巨噬细胞活化，即经典的M1和替代的M2，在许多病理生理过程中发挥着关键作用，如炎症、组织损伤和修复。虽然巨噬细胞活化的调控已经进行了广泛的研究，但对于长非编码RNA（lncRNAs）在这一事件中的作用却知之甚少。在这项研究中，我们发现lncRNA Malat1在不同活化的巨噬细胞中的表达受到明显调节，因为它在LPS处理的细胞中上调，而在IL-4处理的细胞内下调。Malat1敲除减弱LPS诱导的M1巨噬细胞活化。相反，Malat1基因敲除增强了IL-4激活的M2分化以及巨噬细胞纤维化表型。从机制上讲，Malat1基因敲除导致Clec16a的表达降低，这种现象的沉默复制了Malat1对M1激活的调节作用。有趣的是，Malat1基因敲除促进线粒体丙酮酸载体（MPC）的IL-4诱导及其对葡萄糖衍生氧化磷酸化（OxPhos）的介导，这对Malat1调节M2分化和纤维化表型至关重要。此外，Malat1的全局或条件性骨髓敲除小鼠表现出LPS诱导的全身和肺部炎症和损伤减少。相反，这些小鼠出现了更严重的博莱霉素诱导的肺纤维化，伴随着肺泡巨噬细胞显示M2增强和纤维化前表型。总之，我们已经确定了我们认为之前未被认识到的Malat1在巨噬细胞极化调节中的作用。我们的数据表明，Malat1与异常巨噬细胞活化相关，参与肺部疾病。

关键词：细胞免疫反应；纤维化；免疫学；巨噬细胞；肺病。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。在差异激活的巨噬细胞中，lncRNA Malat1的表达发生明显变化。
(A类)在指定的时间段内，用100 ng/ml LPS处理小鼠BMDM。分离总RNA并通过实时PCR测定Malat1水平。n个=4；平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）与时间“0”相比<0.01。(B类)在指定的时间段内，用100 ng/ml LPS处理人PBMC-derived巨噬细胞。测定了Malat1的水平。n个=4；平均值±SD**P（P）与时间“0”相比<0.01。(C类)在指定的时间段内，用100 ng/ml LPS处理人类THP-1衍生的巨噬细胞。测定了Malat1的水平。n个= 3; 平均值±SD*P（P）与时间“0”相比<0.05。(D类)BMDM接受或不接受100 ng/ml LPS治疗1小时。进行ChIP分析。p65与马拉特1实时PCR检测启动子。n个= 3; 平均值±标准差***P（P）与“–LPS”相比<0.001。(E类)在指定的时间段内，用5 ng/ml小鼠IL-4治疗BMDM。测定了Malat1的水平。n个=4；平均值±SD**P（P）与时间“0”相比<0.01。(如果和G公司)BMDM接受或不接受100 ng/ml LPS治疗6小时或5 ng/ml IL-4治疗24小时。进行细胞分级，并分离细胞质和细胞核部分中的RNA。微管蛋白α1和Sno-142水平(如果)和Malat1(G公司)通过实时PCR检测各组分的含量。n个= 3; 平均值±标准差**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 双尾学生的t吨已使用测试(A类–G公司)分析统计学意义。代表2到3个独立实验。
图2
图2。Malat1敲除减弱巨噬细胞的促炎激活。
(A类)用20 nM对照（con）GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染48小时后，用或不用100 ng/ml LPS处理细胞6小时。分离总RNA并通过实时PCR测定Malat1水平。n个=4；平均值±标准偏差(B类和C类)实验按如下所示进行A类.mRNA(B类)和蛋白质(C类)通过实时PCR或ELISA测定指示的促炎细胞因子水平。n个= 3–4; 平均值±标准偏差(D类)实验按如下进行A类按照方法中所述进行细菌杀灭试验。n个= 3; 平均值±标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）通过Bonferroni事后检验的单因素方差分析<0.001(A类–D类). 3个以上独立实验的代表。
图3
图3。Malat1调节C型凝集素结构域家族16成员A（Clec16a）的表达，这是巨噬细胞促炎激活所必需的。
(A类)用20 nM对照（con）GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染48小时后，用或不用100 ng/ml LPS处理细胞6小时。分离总RNA并通过实时PCR测定Clec16a水平。n个= 3; 平均值±SD*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，采用Bonferroni检验进行单因素方差分析。(B类–D类)BMDM公司(B类)，人PBMC-derived巨噬细胞(C类)和THP-1衍生的巨噬细胞(D类)用100 ng/ml LPS处理指定时间。通过实时PCR测定Clec16a和Malat1水平。n个=3–4；平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,#P（P）< 0.05,##P（P）与时间“0”、双尾学生的相应水平相比<0.01t吨测试。(E类和如果)用20 nM con siRNA（开条）或Clec16a siRNA（闭条）转染BMDM。转染48小时后，用或不用100 ng/ml LPS处理细胞6小时。信使核糖核酸(E类)或蛋白质(如果)通过实时PCR或ELISA测定指示基因的水平。n个= 3; 平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）与“con-si”组、双尾学生组相比，<0.01t吨测试。(G公司)BMDM与con-siRNA、con-GapmeR、Clec16a-siRNA和Malat1-GapmeR联合转染，如图所示。转染48小时后，用或不用100 ng/ml LPS处理细胞6小时。通过实时PCR测定指示基因的水平。n个=4；平均值±SD*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，采用Bonferroni检验进行单因素方差分析。2个独立实验的代表。
图4
图4。Malat1髓样消融(马拉特1我的–/–)减轻LPS诱导的ALI。
(A类)肺泡巨噬细胞取自马拉特1飞行/飞行和马拉特1我的–/–老鼠。通过实时PCR检测细胞中的Malat1水平。n个=6个马拉特1飞行/飞行和马拉特1我的–/–老鼠；平均值±标准偏差(B类和C类)马拉特1飞行/飞行和马拉特1我的–/–小鼠静脉滴注50μl生理盐水或50μl盐水中5 mg/kg LPS。给药48小时后，处死小鼠并制备肺匀浆。通过ELISA测定指示的促炎细胞因子水平。n个每组=3,6,5,6只小鼠；平均值±标准偏差(D类–如果)实验按如下所示进行B类和C类通过ELISA测定指示的促炎细胞因子的BALF水平。n个每组=4、6、3、6只小鼠；平均值±标准偏差(G公司)实验按如下所示进行B类和C类用ELISA法测定肺MPO水平。n个每组=3,6,5,5只小鼠；平均值±标准偏差(H（H）)实验按如下所示进行B类和C类进行H&E染色。原始放大倍数，×10。比例尺：200μm。(我)实验按如下所示进行B类和C类给药后24小时，采集肺泡巨噬细胞，通过实时PCR测定指示基因的mRNA水平。●马拉特1飞行/飞行盐水，■马拉特1飞行/飞行LPS，▲马拉特1我的–/–生理盐水马拉特1我的–/–LPS；n个=每组6、4、6、4只小鼠；平均值±标准偏差(J型)实验按如下所示进行B类和C类给药后24小时，采集肺泡巨噬细胞并测定Clec16a的mRNA水平。n个=4，每组4只小鼠；平均值±标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）通过Bonferroni事后检验的单因素方差分析<0.001(B类–我)或双尾学生的t吨测试(J型).
图5
图5。Malat1敲除促进巨噬细胞的选择性激活。
(A类)用20 nM对照（con）GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染48小时后，用或不用5 ng/ml IL-4处理细胞24小时。通过实时PCR测定指示基因的水平。n个=4；平均值±标准偏差(B类)实验按如下所示进行A类Arg-1和YM-1水平通过Western blotting或ELISA测定。n个= 3; 平均值±标准偏差(C类)马拉特1飞行/飞行和马拉特1我的–/–小鼠在50μl盐水中静脉滴注IL-4（1μg）/抗IL-4抗体（5μg）免疫复合物（IL-4c）。给药后24小时，收集肺泡巨噬细胞并测定指示基因的水平。n个每组=2,3,3只小鼠；平均值±SE(D类)用20 nM con GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染后24小时，对细胞进行胰蛋白酶处理，并将其置于Seahorse XF-24微孔板上。电镀后24小时，细胞在没有（顶部）或（底部）5 ng/ml IL-4的情况下处理24小时。然后用OCR分析培养基替换培养基并培养1小时，然后依次用3μg/ml寡霉素（Oligo）、6μM FCCP和1μM鱼藤酮（Rot）加0.5μM抗霉素A（Ant）处理。记录了实时OCR。n个每种情况=5；平均值±标准误差。代表2-4个独立实验*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）采用Bonferroni的事后检验，通过单因素方差分析得出<0.001。
图6
图6。Malat1对巨噬细胞交替激活的调节依赖于葡萄糖代谢。
(A类)用20 nM对照（con）GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染48小时后，用载体或2 mM 2-DG预处理细胞1小时，然后用5 ng/ml IL-4处理12小时。通过实时PCR测定所示M2标记的水平。n个=4；平均值±标准偏差(B类)用20 nM con GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染后48小时，用或不用5 ng/ml IL-4处理细胞12小时。通过实时PCR检测MPC1和MPC2的水平。n个=4；平均值±标准偏差(C类和D类)实验按如下方式进行A类，除了用载体预处理细胞外，50μM UK-5099(C类)，或200 nM鱼藤酮(D类)持续1小时。n个= 3–4; 平均值±标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）通过Bonferroni事后检验的单因素方差分析<0.001(A类–D类). 2到4个独立实验的代表。
图7
图7。Malat1敲低促进巨噬细胞的促纤维化分化。
(A类)将50μl生理盐水或1.5 U/kg博莱霉素（BLM）注入50μl盐水中。给予博莱霉素三周后，收集BAL细胞，并按照方法中的描述对驻留和招募的肺泡巨噬细胞进行分类。通过实时PCR检测Malat1水平。n个=3只，每组3只；平均值±标准偏差(B类和C类)用20 nM对照（con）GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染48小时后，用来自小鼠的BALF处理细胞48小时，所述小鼠用生理盐水或1.5U/kg博来霉素腹膜内处理3周。通过实时PCR测定指示基因的水平。n个=4；平均值±标准偏差(D类和E类)用20 nM con GapmeR或Malat1 GapmeR.转染BMDM。转染48小时后，用载体2 mM 2-DG预处理细胞(D类)，或50μM UK-5099(E类)持续1小时，然后用生理盐水或1.5 U/kg博莱霉素腹腔注射小鼠的BALFs治疗3周。通过实时PCR测定指示的肝纤维化前标志物水平，并将其归一化为用conGapmeR和生理盐水BALF处理的细胞组。n个= 3; 平均值±标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）通过Bonferroni事后检验的单因素方差分析<0.001(A类–E类). 2个独立实验的代表。
图8
图8。Malat1的髓样消融促进博莱霉素诱导的肺纤维化。
(A类)马拉特1飞行/飞行和马拉特1我的–/–小鼠静脉滴注50μl生理盐水或1.5 U/kg博莱霉素（BLM）于50μl盐水中。给予博莱霉素三周后，处死小鼠并制备肺匀浆。测定了整个肺中的羟脯氨酸水平。n个每组=3,9,4,10只小鼠；平均值±标准偏差(B类)实验按如下方式进行A类用10%福尔马林固定肺组织并制备切片。进行Masson三色染色。原始放大倍数，×20。比例尺：100μm。(C类和D类)实验按如下方式进行A类收集BAL细胞，并对驻留和募集的巨噬细胞进行分类。肺泡巨噬细胞总数(C类)以及常驻和招募巨噬细胞的相对数量(D类)已确定。n个每组=3,3,3只小鼠；平均值±标准偏差(E类–H（H）)实验按如下方式进行A类制备BALFs，并采集BALFs中的肺泡巨噬细胞。通过实时PCR测定细胞中指示基因的水平。●马拉特1飞行/飞行土地管理局▲马拉特1我的–/–土地管理局；n个=每组9只小鼠；平均值±标准偏差*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）通过Bonferroni事后检验的单因素方差分析<0.001(A类,C类–H（H）).
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