Spontaneous advent of genetic diversity in RNA populations through multiple recombination mechanisms

doi:10.1261/rna.068908.118

.2019年4月；25(4):453-464.

doi:10.1261/rna.068908.118。 Epub 2019年1月22日。

通过多重重组机制自发出现RNA群体的遗传多样性

本尼迪克特·A·斯迈尔^#¹, 布莱斯·克利夫顿^#¹, Ryo Mizuuchi先生¹, 尼尔斯·雷曼¹

附属公司

PMID： 30670484
预防性维修识别码： PMC6426292型
内政部： 10.1261/rna.068908.118

RNA群体通过多种重组机制自发出现遗传多样性

本尼迪克特·A·斯迈尔等。核糖核酸. 2019年4月.

.2019年4月；25(4):453-464.

doi:10.1261/rna.068908.118。 Epub 2019年1月22日。

作者

本尼迪克特·A·斯迈尔^#¹, 布莱斯·克利夫顿^#¹, 水口龙雄¹, 尼尔斯·雷曼¹

附属

¹波特兰州立大学化学系，美国俄勒冈州波特兰97207。

^#贡献均等。

PMID： 30670484
预防性维修识别码： PMC6426292型
内政部： 10.1261/rna.068908.118

摘要

从益生元化学物质到核糖核苷酸甚至短RNA寡聚体，有几种看似合理的非生物合成路线。然而，为了完善RNA世界假说以帮助解释地球上生命的起源，需要有一种方式，使这些寡聚体能够增加其长度并扩大其序列多样性。后续自然选择的原料需要长度至少超过10-20个核苷酸的低聚物。在这里，我们探索了自发RNA-RNA重组作为一种简单的方法，通过这种方法可以实现长度和多样性的增强。由于发现RNA寡聚体在冰箱中长时间储存会延长其长度，我们系统地研究了RNA-RNA重组过程。除了一种已知的机制外，我们还发现了至少三种新的机制。其中，一个RNA寡聚物充当夹板，催化其他两个寡聚体的杂交，并促进一个寡聚物的5'-OH、3'-OH或2'-OH-亲核试剂攻击另一个寡聚体的目标原子。这导致了一个RNA片段的置换和新的重组低聚物的产生。我们表明，这一过程可以解释体外和电子版中序列复杂性的自发出现。

关键词：RNA；低聚物；生命起源；重组；核酶。

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数字

**图1。**
RNA在−15°C下的长期培养会导致重组。(A类)2年后随机16聚体的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。从凝胶中切下一系列约17–48个核苷酸的产物，并进行高通量序列（HTS）分析。在32nt处可以看到一条微弱的带，可能来自高度互补的抗变性双链RNA。(B类)通过HTS分析确定的序列长度分布。箭头表示一个重组事件（16-mer+16-mer→31-mer+1-mer）以上计数的下降。(C类)来自25-30nt范围内产品HTS分析的核苷酸身份热图。在假定的重组连接处（距离3′末端16 nt）可以看到胞嘧啶富集和腺苷缺失。(D类)通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，SYBR Green染色显示新鲜16-mer LO1（CUC UCC UUC CUG AAA A；富含嘧啶）RNA和2年期LO2（GAG AGC AGG AA；富含嘌呤）RNA的比较。数字是指RNA长度，如核苷酸所示。这些低聚物的极端嘌呤/嘧啶偏倚解释了它们轻微的迁移率差异。

**图2。**
自发RNA–RNA重组方案。(A类)两步劈开-结扎机制如前所示（Lutay等人，2007年），并在本文中得到证实，并将其指定为α机制。在第一步中，夹板（绿色）低聚物与两种底物低聚物杂交左边底物（黑色）经过自发裂解，在生成的3′-核苷酸上生成2′，3′-环磷酸。在第二步中*正确的*底物（蓝色）攻击，导致新的磷酸酯键。(B类)先前提出的理论化交叉攻击（Pino等人，2013）。16-mer系列**16兰特**和13-merH13型我们设计用来测试这种反应的一种排列，但我们手中没有检测到反应产物(补充图4). (C类)的变体α当三元复合物**16兰特**(顶部)或**H13型**(底部)表单。所示的复合反应被指定为α′机制。(D类)重组的另一种变体，可能发生在**16兰特**三元络合物。这里，一条底物链的3′-OH（或可能是2′-OH）取代了另一条底物质链的末端5′-核苷酸。所示反应被指定为β机制。(E类)另一个检测到的重组反应产生分支产物。在三元络合物形成后**16兰特**或**H13型**，2′-OH在不同位置对杂交链的攻击产生一系列产物，这些产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分支并缓慢迁移。这些反应被指定为γ或γ′机制，具体取决于基板。

**图3。**
自发RNA-RNA重组的凝胶电泳图。(A类)在100 mM MgCl中在22°C下重组RNA 3天₂使用30µM，每个5′-³²凝胶上的P标记低聚物（由*指定）。产物RNA通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并通过磷光成像显示。请注意，10-nt梯状物（M，长度以nt计）含有3′-磷酸盐，因此其迁移速度比凝胶上的其他RNA快～1 nt。(B类)100µM的几天时间过程**16兰特**(左边)和**H13型**在0°/22°C的100 mM氯化镁中自孵育₂pH值8.0。产物RNA通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用SYBR金染色。标记车道（M）是已知长度的5′-OH RNA的混合物。指出了生成产品带的拟议机制。(C类)5′磷酸化和脱氧残基的包合作用**16兰特**(左边)和**H13型**(*正确的*). 磷酸化抑制α′（和β)机制，但不是γ或γ′机制（至少在**16兰特**). 含脱氧低聚物的序列如下：**16兰特**（2′-dG）=CGU ACC GUU GCA UUU dG；**16兰特**（2′-d{AUUU}）=CGU ACC GU GCdA dUdUdU G；**H13型**（2′-dG）=CUG CAA CGG UAC dG；**H13型**（2′-dG）=CUG CAA CGG UAdC G.{+}通道为阳性对照，所有含5′-OH的核糖低聚物均被利用。产物RNA通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用SYBR金染色。(D类)孵育5天后的反应产物**16兰特**在0°C/22°C的100 mM氯化镁中₂在不同的pH值下。阴性对照{−}未分离**16兰特**RNA。产物RNA通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用SYBR金染色。

**图4。**
R16自插管产品相对电泳带强度和高温超导频率的比较。（蓝色条）28-、29-和30-mers的相对带强度(α'产品），以及31-mers(β产品）。（红色条）表1中HTS命中的相对数量。缩放为总和的值等于1.0。

**图5。**
RNA寡聚体随机池上重组迭代循环的核苷酸显式计算机模拟。对1–15 nt（橙色）随机低聚物初始池的频率分布与20亿次重复重组后的最终分布进行了比较，模拟了α来自初始池的机制不是（蓝色）或（灰色）用2′，3′环磷酸盐预激活（>）。

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