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.2018年12月1日；29(25):2989-3002.
doi:10.1091/mbc。E18-04-0242。 Epub 2018年10月3日。

Cdt1变异体揭示了与细胞周期蛋白/CDK和MCM相互作用的意外方面，这对正常基因组复制很重要

佩德罗·波佐 1, 雅各布·P·马特森 2, 亚塞米·科尔 三, Katarzyna M Kedziora公司 三, 加文·D·格兰特 2 4, 布伦达神庙 2 5 6, 珍妮特·戈文（Jeanette Gowen Cook） 1 2 4
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Cdt1变异体揭示了与细胞周期蛋白/CDK和MCM相互作用的意外方面，这对正常基因组复制很重要

佩德罗·波佐等。 摩尔生物细胞. .

摘要

DNA复制的最早步骤是起源许可，即微染色体维持（MCM）解旋酶复合体的DNA装载。Cdc10-依赖性转录1（Cdt1）蛋白对于细胞周期G1期的MCM负载至关重要，但Cdt1功能的机制尚不完全清楚。我们检查了一组罕见的Cdt1变体，这些变体会导致一种原始侏儒症（Meier-Gorlin综合征）和一种亚形态果蝇属阐明Cdt1功能的等位基因。三种低形态变体负载MCM的效率低于野生型（WT）Cdt1，其活性较低与MCM结合受损有关。人类Cdt1-MCM复合体的结构同源模型将改变后的Cdt1残基定位在两个不同的界面，而不是之前描述的单个MCM相互作用域。令人惊讶的是，一个侏儒等位基因(代码1-A66T)比WT Cdt1更活跃。这种超形态变体结合细胞周期蛋白A和SCF细胞S期激酶相关蛋白2与WT Cdt1相比较差。然而，详细的定量活细胞成像分析表明，这种变体的稳定性没有变化。相反，我们建议细胞周期蛋白A/CDK独立于SCF的产生而抑制Cdt1许可功能细胞S期激酶相关蛋白2磷酸二氢。总之，这些发现确定了有效的来源许可和严格的Cdt1调控所需的关键Cdt1相互作用，以确保正常的细胞增殖和基因组稳定性。

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数字

图1：
图1：
通过重复制诱导对Cdt1变体进行功能分析。（A） 说明本研究中所选等位基因的相对位置和氨基酸替代；还标记了多组氨酸和HA表位标签以及相关的结合域。（B） 稳定整合的HA标记WT-Cdt1在U2OS细胞中诱导表达的免疫印迹。细胞分别在0、0.05、0.1和1µg/ml多西环素（dox）中生长。（C） U2OS细胞表达载体、异位HA标记的WT-Cdt1或指示的HA标记的Cdt1变体的流式细胞术分析图谱。用1µg/ml dox处理细胞72小时，并在收获前用EdU脉冲标记30分钟。还显示了浇口方案的图示；“>4C DNA”是经过DNA重复制的细胞。（D） 光照条件下C.Light Exp.细胞Cdt1表达的免疫印迹；深色曝光，深色曝光。（E） 至少四次生物复制中DNA含量大于4C的细胞百分比。条形代表平均值和SD****对值<0.0001**对值<0.005*对值<0.05；n.s.=无显著差异。
图2：
图2：
Cdt1变异体过度生产导致的DNA损伤和细胞增殖缺陷。（A） 在1µg/ml dox中生长48小时的U2OS细胞中的HA标记的Cdt1（抗HA抗体）、pChk1（S345）和总Chk1的免疫印迹。条形图表示三个生物重复的平均值和标准差****对值<0.0001***对值=0.0001*对值<0.05；n.s.=无显著差异。（C） Top、Representative vector和WT Cdt1控制克隆形成分析。在存在或不存在1µg/ml多西环素（dox）的情况下，以低密度铺板细胞，并生长约10天。底部，72小时后收获技术复制板，通过用抗Cdt1抗体进行免疫印迹来测定异位Cdt1表达。（D） 将每个实验中的相对菌落形成归一化为矢量控制；值表示至少三个生物复制。条形代表平均值和SD**对值<0.005；n.s.=无显著差异。
图3：
图3：
MCM加载的功能分析。（A） 用100 nM对照siRNA（左）或Cdt1 siRNA（右）处理的U2OS细胞中染色质结合MCM的流式细胞术分析图。在采集和提取可溶性MCM之前，用10µM EdU脉冲标记细胞30分钟。用抗MCM2抗体检测结合（未提取）的MCM，用DAPI染色细胞以检测总DNA含量。蓝色：MCM绑定阳性，EdU阴性，G1 DNA含量；橙色：EdU阳性，MCM绑定积极；灰色：EdU阴性，MCM绑定消极。（B） G1 MCM直方图绑定阳性，EdU阴性（即A中为蓝色）细胞，来自A中的两个样本x个-上的轴和标准化单元格计数年-轴（计数标准化为siControl）。（C） G1 MCM柱状图绑定与B中的WT Cdt1相比，缺失内源性Cdt1并表达每个Cdt1变体的阳性细胞在0.002–0.006µg/ml多西环素中培养72 h，然后进行EdU标记和处理C类用抗Cdt1抗体检测。（E） G1（绿色/蓝色）和早期S（橙色）MCM载荷的补充归一化为WT Cdt1。平均MCM绑定每个变量的加载强度除以每个实验中WT Cdt1的平均MCM加载强度。早期S期定义为G1 DNA含量和EdU阳性，用A括号表示；另请参见补充图S3B。条形代表三个生物重复的平均值和标准差*对值<0.05**对指示值<0.005；另外，WT Cdt1与变异株之间的差异不显著。
图4：
图4：
相对MCM结合。（A–D）WT和指示的Cdt1变体在HEK 293T细胞中瞬时表达，并使用HA表位标签进行免疫沉淀。检测部分（2%）全细胞裂解物和结合蛋白的HA-Cdt1（抗HA抗体）和MCM2作为MCM复合物的标记物；免疫球蛋白G或珠用作对照（CTRL）。（E） 上图，人类MCM2-7-Cdt1复合体的同源模型。以酵母OCCM结构（PDB ID:5UDB）为模板，模拟人MCM2-7复合物；数字表示单个MCM亚基，颜色与Yuan等人（2017）中的相似。人类C-末端Cdt1翼螺旋结构“Cdt1-CTD”（PDB ID:2WVR）和小鼠Cdt1中央/中间结构域“Cdt1-MD”（PDB-ID:3A4C）的结构用于模拟hCdt1-hMCM相互作用。底部，左侧，R210以绿色突出显示的拟议交互曲面的放大视图。底部，右侧，R462和E468提议交互表面的放大视图，以绿色突出显示。
图5：
图5：
Cdt1-A66T损伤细胞周期蛋白A和Skp2结合，但不能稳定Cdt1在S期。（A） SCF图解细胞S期激酶相关蛋白2-通过CDK介导的苏氨酸29磷酸化依赖性降解WT Cdt1。（B） 细胞在1µg/ml dox（高）中培养18 h，裂解，并与镍琼脂糖孵育以回收His标记的Cdt1。检测部分全细胞裂解物（2%）和结合复合物中的指示蛋白质（底部面板抗HA抗体）。（C） 上图，细胞周期中Cdt1降解和积累的图示。底部，表达Cdt1-WT和Cdt1-A66T的U2OS细胞通过双胸苷/诺卡唑（1–5道）或双胸苷（6–10道）阻断进行同步化，并释放到新鲜培养基中。在释放后取时间点，并用抗Cdt1抗体通过免疫印迹进行分析。非特定带用作加载控制。（D） 每10分钟异步增殖期间U2OS细胞中WT或A66T Cdt1-Venus表达的强度。痕迹是从有丝分裂（0%）到有丝分裂的任意单位中的平均Venus强度（100%细胞周期进展）；n个=50个单元格。白色圆圈表示S相的开始和结束，由稳定共存的荧光标记PCNA的定位决定。（E） 50个随机选择的U2OS细胞中Cdt1 WT-Venus（左）和Cdt1-A66T-Venus（右）的荧光强度热图。根据细胞周期的持续时间排列单个细胞的地图；颜色表示荧光水平的差异。每个轨迹中的白点表示S期的开始和结束，由稳定共存的荧光标记PCNA的定位决定。
图6：
图6：
CDK-Cdt1结合独立于Cdt1磷酸化简抑制重复制。（A） 用1µg/ml多西环素处理48小时的细胞的流式细胞术分析曲线，如图1所示进行分析。Cy:cyclin/CDK结合基序突变体；2A:Cdt1 T29A，S31A。（B） 至少三次生物复制中DNA含量大于4C的细胞百分比。条形代表平均值和SD*对值<0.05；n.s.=无显著差异。（C） 用抗Cdt1抗体免疫印迹A的全细胞裂解物检测HA标记的Cdt1；一个非特异性带作为负荷控制；车辆=矢量。
图7：
图7：
低形态或高形态Cdt1变体的细胞增殖缺陷模型。（A） WT Cdt1支持正常MCM加载/来源许可和S阶段的正常DNA复制。（B） A66T变体因CDK介导的抑制而受损，导致重新授权和重新复制。R210C、R462Q和E468K变体在G1期的MCM2-7结合受损，导致起源许可缓慢，从而导致G1进展延迟。这两种情况最终都会导致扩散缺陷。
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