Methanomethylophilus alvus Mx1201 Provides Basis for Mutual Orthogonal Pyrrolysyl tRNA/Aminoacyl-tRNA Synthetase Pairs in Mammalian Cells

doi:10.1021/acschembio.8b00571

.2018年11月16日；13(11):3087-3096.

doi:10.1021/acschembio.8b00571。 Epub 2018年10月12日。

嗜甲烷菌Mx1201为哺乳动物细胞中相互正交的吡咯烷酰-tRNA/氨酰-tRNA合成酶对提供基础

Birthe Meineke出生¹, 约翰内斯·海姆加特纳¹, 洛伦佐·拉夫兰奇¹, 西蒙·埃尔萨瑟¹

附属公司

PMID： 30260624
预防性维修识别码： PMC6243396型
内政部： 10.1021/acschembio.8b00571

嗜甲烷菌Mx1201为哺乳动物细胞中相互正交的吡咯烷酰-tRNA/氨酰-tRNA合成酶对提供基础

Birthe Meineke出生等。 ACS化学生物. 2018.

.2018年11月16日；13(11):3087-3096.

doi:10.1021/acschembio.8b00571。 Epub 2018年10月12日。

作者

Birthe Meineke出生¹, 约翰内斯·海姆加尔特纳¹, 洛伦佐·拉弗兰奇¹, 西蒙·埃尔萨瑟¹

附属

¹瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所医学生物化学和生物物理系生命科学实验室。

PMID： 30260624
预防性维修识别码： PMC6243396型
内政部： 10.1021/acschembio.8b00571

摘要

通过终止密码子抑制进行遗传代码扩展是一种利用位点特异性编码的非经典氨基酸（ncAAs）在哺乳动物细胞中构建蛋白质的强大技术。目前的方法依赖于哺乳动物细胞中极少数正交的可用tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对，来自甲烷八叠球菌（Mma-PylRS/PylT）的吡咯烷酰-tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶是迄今为止最活跃和最通用的。我们发现，来自人类肠道古菌嗜甲烷菌Mx1201（Mx1201 PylRS/PylT）的吡咯烷基tRNA/氨酰-tRNA合成酶对在哺乳动物细胞中具有活性且正交。我们表明，这种PylRS酶可以通过工程来扩展其ncAA底物光谱。我们发现，由于两对进化距离较大，Mx1201 PylRS/PylT与Mma PylRS/PylT部分正交。通过Mx1201 PylT的有理突变，我们消除了它与Mma-PylRS的非认知交互作用，创建了两个相互正交的PylRS/PylT对。在同一个细胞中结合，我们发现这两个对可以选择性地引入两个不同的ncAA，以响应两个截然不同的终止密码子。我们的工作扩展了哺乳动物细胞中遗传密码扩增的相互正交工具，并为细胞生物学和蛋白质生产的先进体内蛋白质工程应用提供了基础。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
的不同特征*Mx1201型*和*Mma（马）*PylRS/PylT对。（a）*马氏甲烷八叠球菌*（缩写）作为*Mma（马）*，以蓝色显示）PylRS和*嗜甲烷菌阿尔维斯Mx1201*（缩写为*Mx1201型*，如图所示珊瑚中）PylRS结构域和同源区域。（b）三叶草的结构*Mma（马）*和*Mx1201型*PylTs公司。同源PylRS的卡通显示了N和之间的识别位点C末端结构域（NTD，CTD）和tRNA。

图2
*Mx1201型*PylRS/PylT对有效且正交在哺乳动物细胞中；*Mx1201型*PylRS和*Mma（马）*PylT是正交的，而*Mma（马）*PylRS费用二者都*Mma（马）*和*Mx1201型*管道。（a）荧光瞬时转染HEK293T细胞裂解物的平板读取器分析带GFP^150标签记者携带*Mma（马）*或*Mx1201型*PylT暗盒，与*Mma（马）*或*Mx1201型*PylRS，比例为9:1。GFP公司荧光显示为用在同一实验中，构建了一个没有TAG终止密码子（GFPctrl）的GFP结构。对于每个组合，进行四次重复转染。对于四个样品中的三个，在培养基中添加0.2mM CpK；转染后24h收集所有样本。请参见支持信息图4用于荧光转染细胞的显微镜照片。（b） HEK293T蛋白印迹如上转染的细胞裂解物显示GFP的表达，FLAG标记的合成酶变体和β-肌动蛋白负载控制。（c）含CpK纯化GFP的完整质量测定150台生产*Mma（马）*和*Mx1201型*PylRS/PylT，以及使用*Mx1201型*PylRS公司^126A日元/管道。全反褶积单同位素绘制25–30 kDa质量范围内的质量图，并预测为了进行比较，给出了单同位素质量。（d） In-gel远红外荧光图像和针对HEK293T细胞裂解物中GFP的Western blot。裂解物用硅罗丹明四嗪（SiR-Tet）荧光标记染料。

图3
基底特性属于*Mx1201型*PylRS/PylT和*Mx1201型*PylRS公司^126A日元/管道。荧光板阅读器以4:1比例瞬时转染HEK293T细胞裂解物的检测带有GFP^150标签记者和（a）*Mma（马）*PylRS/PylT，（b）*Mx1201型*PylRS/PylT，（c）*Mx1201型*PylRS公司^126A日元/PylT或（d）*Mma（马）*PylRS AF/PylT。GFP荧光以荧光百分比表示用GFP构建物测量，在相同的GFP中没有TAG终止密码子实验。细胞在没有（-ncAA）或存在的情况下生长24小时以下ncAA之一：0.2 mM CpK、0.5 mM BCNK、0.1 mM TCO*K、，0.5 mM AbK、0.5 mM PcK和10 mM AcK。对于全名和结构氨基酸，参见支持信息图3.

图4
*Mma（马）*PylRS公司与非昆虫相互作用*Mx1201型*通过其PylTN端域。（a）顶部方案显示C端子域（CTD）构造用于*Mma（马）*PylRS，包含与全长相对应的区域*Mx1201型*PylRS公司。底部方案表示已知的身份元素（受体干和变量循环）*Mx1201型*PylT结构和假定的*Mx1201型*PylRS和*Mma（马）*PylRS.（b）HEK293T荧光板阅读器分析如图1所示瞬时转染的细胞裂解物。GFP荧光以百分比表示用无TAG终止密码子的GFP构建物测量的荧光强度在同一个实验中。细胞在有或无条件下生长0.2 mM CpK持续48小时（c）Western blot显示FLAG标记的合成酶变体、GFP和β-肌动蛋白负荷控制。

图5
中的突变*Mx1201型*PylT变量循环中断通过识别嗯PylRS，导致正交PylRS/PylT对。（a）描述主要识别模式的方案在PylRS和同源PylTs之间：*Mx1201毫米*PylRS，英寸NTD的缺失可能只与受体保持相互作用阀杆。*Mma（马）*PylRS CTD既不识别也不识别*Mma（马）*PylT或*Mx1201型*没有NTD的PylT。进一步指出的是在*Mx1201毫米*预计将取消与这个*Mma（马）*PylRS NTD公司。（b）荧光板阅读器以5:1:4比例瞬时转染HEK293T细胞裂解物的检测带有GFP^150标签报告子和指示合成酶GFP荧光显示为荧光百分比用GFP构建物测量，在相同的GFP中没有TAG终止密码子实验。对于每种组合，四重转染是已执行。对于四个样品中的三个，补充培养基含0.2 mM CpK；转染后48h采集标本。注意破损的年轴。（c）蛋白质印迹显示FLAG标记合成酶变体、GFP和β-肌动蛋白的表达装载控制。（d） HEK293T细胞瞬时裂解产物的Western blot以1:9的GFP比例转染^150标签记者和任何一方*Mx1201型*PylT公司^C41CA公司/嗯PylRS或*Mx1201型*PylT公司^C41CA公司/*Mx1201型*PylRS，显示FLAG标记的合成酶变体、GFP和β-肌动蛋白负荷控制。转染时加入CpK；转染后48h采集标本。

图6
哺乳动物细胞中双ncAA掺入相互作用正交的PylRS/PylT对。（a）双ncAA合并方案哺乳动物细胞中的正交PylRS/PylT对。两种PylRS变体选择具有窄底物特异性的两种ncAA（TCO*K和AcK）响应不同的终止密码子。化学品给出了ncAA的结构。在此中使用的PylRS和PylT变体给出了实验结果。（b） Western blot和SiR-Tet标记以4:4:1:1的比例瞬时转染HEK293T细胞以下组件：GFP^{102TAG150TAA公司}4×记者*Mx1201型*PylT公司^C41CA公司、GFP^{102TAG150TAA公司}记者带4×嗯PylT公司^UUA公司,*Mx1201型*PylRS公司^{Y（Y）126个}带4×*Mx1201型*PylT公司^C41CA公司、和*Mma（马）*AcKRS带4×*Mma（马）*PylT公司^UUA公司分析裂解物的表达FLAG标记的合成酶变体、GFP和β-肌动蛋白负载控件。值得注意的是，可检测的AcKRS蛋白水平取决于AcK底物的存在。（c）转染后的荧光图像HEK293T细胞用于细胞裂解前的b组。

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