Mapping 3D genome organization relative to nuclear compartments using TSA-Seq as a cytological ruler

doi:10.1083/jcb.201807108

.2018年11月5日；217(11):4025-4048.

doi:10.1083/jcb.201807108。 Epub 2018年8月28日。

用TSA-Seq作为细胞学标尺绘制与核隔室相关的3D基因组组织

附属公司

¹伊利诺伊大学厄本那-香槟分校细胞与发育生物学系，伊利诺伊州厄本那。
²伊利诺伊大学厄本那-香槟分校生物工程系，伊利诺伊州厄本那。
^三宾夕法尼亚州匹兹堡卡内基梅隆大学计算机科学学院计算生物学系。
⁴荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所基因调控司。
⁵伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系。
⁶伊利诺伊大学厄本那-香槟分校细胞与发育生物学系asbel@illinois.edu。
⁷伊利诺伊大学厄本那-香槟分校生物物理和定量生物学中心，伊利诺伊州厄本那。
⁸伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校卡尔·R·沃兹基因组生物学研究所。

PMID： 30154186
预防性维修识别码： PMC6219710型
内政部： 10.1083/jcb.201807108

用TSA-Seq作为细胞学标尺绘制与核隔室相关的3D基因组组织

于晨等。 J细胞生物学. 2018.

.2018年11月5日；217(11):4025-4048.

doi:10.1083/jcb.201807108。 Epub 2018年8月28日。

附属公司

¹伊利诺伊大学厄本那-香槟分校细胞与发育生物学系，伊利诺伊州厄本那。
²伊利诺伊大学厄本那-香槟分校生物工程系，伊利诺伊州厄本那。
^三宾夕法尼亚州匹兹堡卡内基梅隆大学计算机科学学院计算生物学系。
⁴荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所基因调控司。
⁵伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系。
⁶伊利诺伊大学厄本那-香槟分校细胞与发育生物学系asbel@illinois.edu。
⁷伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校生物物理和定量生物学中心。
⁸伊利诺伊大学厄本那-香槟分校卡尔·R·沃斯基因组生物学研究所，伊利诺伊州厄本那。

PMID： 30154186
预防性维修识别码： PMC6219710型
内政部： 10.1083/jcb.201807108

摘要

虽然核区隔化是三维基因组组织的一个基本特征，但还没有基因组方法来测量染色体到确定的核结构的距离。在本研究中，我们描述了TSA-Seq，这是一种新的映射方法，能够提供一个“细胞学标尺”，用于估计全基因组范围内核斑点的平均染色体距离，并在无需复杂计算模型的情况下预测核隔室之间的几个Mbp染色体轨迹。K562细胞的集合平均结果显示，清晰的核纹层到斑点轴与基因组活动的显著空间梯度相关。这个梯度代表了多个空间上分离的核结构域的卷积，包括两种类型的转录“热区”。转录热区最深地伸入核内部，并确定地非常靠近核斑点，其总基因数量较高，是表达量最高的基因，看家基因、低转录暂停基因和超增强子。我们的结果证明了TSA-Seq在全基因组核结构定位中的能力，并为转录和基因表达的空间组织提供了一种新的模型。

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数字

**图1。**
**TSA产生生物素标记，生物素标记与染色靶呈指数衰减。（A）**TSA：一级和HRP结合二级抗体（紫色点）靶表位（灰色点）。HRP催化酪胺-生物素自由基（红色）的形成，该自由基扩散并共价连接到附近的蛋白质（灰色点）、DNA（灰色线）和RNA（棕色线）。**（B）**TSA染色扩散指数拟合：条件1（顶部）、条件2（中部）和条件3（底部）。左：与BAC转基因阵列结合的GFP-lac阻遏物（绿色）TSA染色的生物素染色（红色）；白色虚线环绕细胞核，红色箭头标记用于行扫描的GFP点。中间：GFP斑点（绿色）与生物素强度（红色）沿黄线扫描（左侧）。右图：生物素强度与GFP点距离的指数拟合。**（C）**SON免疫染色（绿色）、TSA后生物素染色（红色）和DNA DAPI染色（蓝色）沿黄线扫描的图像（顶部）和强度（底部）。**（D）**SON TSA染色条件1-3的图像。上图：生物素染色（红色）与DAPI DNA染色（绿色）合并。底部：TSA染色表面图。棒材，2µm。

**图2。**
**使用TSA-Seq对与核斑点相关的染色体组织进行全基因组定位。（A）**工作流程示意图。**（B）**SON TSA-Seq基因组图（人类Chr11）：无主要对照（顶部）、TSA染色条件1-3（中部）和层粘连B1 DamID（底部）。红色方框表示SON TSA-Seq峰谷转换与LAD–LAD间转换。**（C）**10个SON TSA-Seq十分位的彩色编码、TSA-Seg分数和估计斑点距离（TSA条件2）。**（D）**对于每个峰（探针A–C）、过渡（探针D和E）和谷（探针F–H）区域，SON TSA-Seq基因组图两侧的探针位置（红色条）显示在左侧；探针到最近散斑的距离直方图(n个=100）显示在右侧，具有代表性的3D免疫FISH图像：SON（绿色）、FISH（红色）和细胞核（白线）。棒材，1µm。**（E）**探针距离最近散斑的方框图(n个= 100).

**图3。**
**从SON TSA-Seq评分推导精确的核斑点全基因组平均距离图。（A）**SON TSA-Seq折叠富集（条件1-3）的指数拟合（红线）与FISH测量的八个探针（黑色方块）的平均散斑距离。**（B）**另外10个FISH探针（开放圆）的富集度和距离测量图接近使用原始八个探针计算的拟合曲线（如条件1所示）。**（C）**自上而下：根据指数拟合（条件1-3）与Repli-Seq DNA复制时间的倒数计算斑点距离（Chr11）。**（D）**条件1和条件2之间全基因组距离残差的直方图计算了斑点距离。

**图4。**
**如所有人类染色体所示，SON和层粘连蛋白B TSA-Seq评分之间的逆相关性。（A）**SON TSA-Seq（黑色）和lamin B TSA-Seg（蓝色）图谱（染色条件2）；y轴显示对数₂在20-kb容器中，TSA归一化与输入DNA归一化读取的比率。为了进行比较，在SON和层粘连蛋白B TSA Seq图之间显示了Hi-C亚组分（GM12878细胞）（颜色代码，右下角）。绘图基于UCSC基因组浏览器中显示的hg19组件。红色方框显示了SON（lamin B）TSA-Seq图中连接谷（峰）到峰（谷）的线性过渡示例。**（B）**SON TSA-Seq大峰（红色方框）、小峰（橙色方框）和谷内峰（绿色方框）分别与层压板B TSA-Seq-大谷、浅谷和峰间凹陷相关。自上而下：K562细胞SON TSA-Seq、层粘连B TSA-Seg和层粘连B1 DamID。

**图5。**
**TSA-Seq与核组织的光学显微镜观察**.（A）自上而下：SON的TSA-Seq（Chr7）、磷酸化SC35、层粘连蛋白B、层粘着蛋白A/C、层粘稠蛋白B1 DamID、RNA Pol II-Ser5p TSA-Seq-Hi-C室特征向量和小室分配。斑点TSA-Seq大峰（红色方框）、小峰（橙色方框）和谷内峰（绿色方框）分别与层TSA-Seg深谷、浅谷和峰间凹陷对齐。**（B）**同一目标SON（从左到右）但有两种TSA标记条件的2D TSA-Seq百分位散点图，SON与pSC35，层粘连A/C与层粘连B，层粘着B与SON，以及RNA Pol II–Ser5p与SON TSA（300-kb bins）。**（C）**上图：相对于DAPI（蓝色；右侧），RNA Pol II–Ser5p（红色）与H3K27me2/3（绿色；左侧）以及RNA Pol II-Ser5p（红）的3D SIM。中间：SON宽视野图像（左侧）叠加在3D SIM RNA Pol II–Ser5p（红色）和DAPI（蓝色）图像（右侧）上。底部：3D SIM DAPI（蓝色）与H3K27me3（绿色；左侧），DAPI和H3K17me3都叠加在广角SON图像上（白色；右侧）。箭头指向由RNA Pol II–Ser5p焦点包围的核斑点。**（D）**5-乙炔尿苷5分钟脉冲标记显示新生RNA（红色）与DNA（DAPI）染色和SON免疫荧光（绿色）。**（E）**RNA Pol II–Ser5p免疫染色（绿色）、TSA染色（红色）和DAPI（蓝色）的图像（顶部）和对齐强度（底部）沿直线扫描（黄色；顶部）。RNA Pol II–Ser5p TSA信号（红色）在核内部较高，但在核周围（和核仁）较低。**（F）**2D层粘连B–SON TSA-Seq散点图显示Hi-C小室的分布（320-kb箱子大小）。

**图6。**
**TSA-Seq预测核边缘和斑点之间的染色体轨迹。（A）**针对连接SON TSA-Seq谷和峰的4-Mbp轨迹的Immuno-FISH。左上角：SON和层粘连B TSA-Seq基因组图和FISH探针位置。右上角：TSA-Seq信号与染色体轨迹的示意图。底部：探头1-4（红色）和探头5（黄色）FISH和DAPI（蓝色）。左下：鱼核信号上方的方框区域。下中：在不同通道和合并图像中查看的轨迹（上）；另外三个示例（底部）。右下：第五个示例。**（B）**针对连接SON TSA-Seq峰谷的3 Mbp轨迹的免疫荧光。顶部：TSA-Seq基因组图和FISH探针位置。左下：探针9（黄色）和探针10-12（红色）FISH和层粘连蛋白B（蓝色）。FISH核信号上方的方框区域。右下：在不同频道中查看的方框区域（顶部）以及三个附加示例（底部）。**（C）**针对SON TSA-Seq谷到峰到谷的～11 Mbp轨迹的免疫免疫。左上（从上到下）：探针位置和SON TSA序列、层粘连蛋白B TSA序列、平滑、归一化的RNA Pol II ChIP序列、RNA序列、GRO序列（20kb仓）、H3K36me3 ChIP和Hi-C亚组分。右：TSA-Seq信号与染色体轨迹的示意图。底部：探针1-4（红色）和探针5-8（黄色）通过层粘连蛋白B（蓝色）染色进行FISH。左下：鱼核信号上方的方框区域。底部中间和右侧：不同的通道（顶部和中部）以及三个附加示例。棒材，1µm。

**图7。**
**单细胞分析显示，基因组区域定位在核斑点或叶片附近，相对于其他隔室显示出随机定位。（A和B）**尽管2D层粘连-SON TSA散点图显示出紧密的负相关，但3D免疫荧光显示，在单个细胞中，给定位点与核斑点或层粘连的细胞学距离并不紧密相关。**（A）**上图：DNA FISH探针相对于核斑点（绿色）和核DNA染色（蓝色，DAPI）的位置（红色；箭头）。探针C（左；十分位10）、D（中；十分位9）和H（右；十分位1；探针与图2、6和S2中相同）分别来自SON TSA-Seq峰、过渡区和谷（与LAD重叠）；十分位数指SON TSA-Seq。底部：2D散点图显示了从最近的核斑点（x轴）和核外围（y轴）到100个等位基因探针C、D和H的最短距离（以微米为单位）。探针C显示距离（～0–0.5µm）非常接近核斑点，但到外围的距离分布很广。相反，探针H显示大多数等位基因与核外围的距离分布相对紧密（～0–0.8µm），但与核斑点的距离分布较广。探针D显示了相对于核散斑和外围具有中等散射度的距离分布。**（B）**探针I至R的10个额外2D散点图（探针与图2、6和S2中的探针相同）。

**图8。**
**沿着斑点-层粘连蛋白TSA-Seq轴的转录相关标记、基因表达和DNA复制时间的梯度反映了细胞和染色体区域的整体平均。（A–D）**基因表达和染色质标记作为SON TSA-seq十分位的功能。**（A）**H3K9me3、H3K27me3和LAD馏分。**（B）**H3K4me3（峰值）、H3K9ac和CTCF（峰值）。**（C）**蛋白质编码基因表达（FPKM；左）、基因密度（中）和前5%活性基因的百分比（右）。方框图（左侧）显示中值（黑线）、平均值（红菱形）、75%（方框顶部）、等于1.5×方框大小的胡须和异常值（黑点）。**（D）**超级增强剂与增强剂（百分比）。**（E和F）**Lamin B与SON TSA-Seq百分位2D散点图（顶部和右侧的投影）。**（E）**表达（红色）与非表达（绿色）蛋白编码基因。**（F）**前5%表达基因（蓝色）与其余表达蛋白编码基因（灰色）。前5%表达的基因距离核膜最远（右；红框）显示出不成比例的向斑点倾斜（>95%SON TSA-Seq百分位；虚线）。**（G）**DNA复制时间（160kb仓大小）：最早到最晚（红色到蓝色）。红色椭圆表示早期复制区域向较高的SON TSA和较低的层粘连B TSA百分位数轻微倾斜。**（H）**A1（左）、A2（中）和A1加A2（右）活性Hi-C小班的分布与SON TSA-Seq十分位数的关系。

**图9。**
**两种类型的转录热点区与SON TSA-Seq局部最大值一致。（A）**平滑RNA Pol II ChIP-Seq最大值标记的近似Mbp转录热点区域的峰值与SON TSA-Seq最大值（红色勾号）对齐。自上而下（Chr2）：SON TSA-Seq、Hi-C亚区、平滑归一化RNA Pol II ChIP-Seq、GRO-Seq（20-kb bins）、RNA-Seq，H3K36me3，RNA Pol II-Ser5p TSA-Seq-Hi-C特征向量（隔室）、Repli-Seq，LAD和RefSeq基因注释。显示SON TSA-Seq局部最大值的箭头与I型（红色）和II型（黄色）转录热点区对齐。**（B）**由A1（深绿色）、A2（浅绿色）、Hi-C小班身份和SON TSA-Seq百分位数（x轴）编码的SON TSA-Seq局部最大数（y轴）的双峰分布。**（C）**A1（红色）与A2（蓝色）SON TSA-Seq峰值的SON TSA-Seq局部最大值与最近LAD/LAD间边界之间基因组距离的方框图。**（D）**两种类型的转录热点区：I型，其顶点映射到核斑点附近；II型，其尖端映射到与核斑点的中间距离。

**图10。**
**I型和II型转录热点区之间的差异和核组织的改进模型。（A）**从左至右：总基因的密度（y轴；基因数），前10%表达的基因，表达水平为40-60%的基因，以及表达水平最低10%的基因，与I型（红色）和II型（蓝色）转录热点区中心的基因组距离（x轴；kb）有关。**（B）**SON TSA-Seq局部最大值±100 kb范围内表达基因的暂停指数分布包含在I型（A1峰）和II型（A2峰）热点区域内。**（C）**所有基因的内务基因与非内务基因相对于SON TSA-Seq十分位数的百分比（y轴）（左），基因仅位于斑点附近的A1亚区（中），或仅位于A2亚区（右）。**（D）**先前的模型：转录活性从靠近核边缘的低水平向核中心的高水平放射状增加。**（E）**新的、改进的模型：转录活性染色体区域从靠近核和核仁外围（黑色）的异色隔室中消失。突入核内部的染色体轨迹顶点与转录热点区的中心相对应，这些热点区位于核斑点（灰色；I型）的外围（红圈）或斑点的中间距离处的内部位点，可能靠近未知的隔室，例如转录工厂（II型）。第二个抑制性隔室在整个核内部富含H3K27me3（绿点）图，分散在RNA Pol II–Ser5p焦点和斑点之间。大型染色质纤维（灰色曲线）在这些隔室之间穿行。

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1. Belmont A.S.和Bruce K.，1994年。G1染色体的可视化：间期染色单体结构的折叠、扭曲、超螺旋染色单体模型。《细胞生物学杂志》。127:287–302. 10.1083/jcb.127.2.287-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bickmore W.A.2013年。人类基因组的空间组织。每年。基因组学评论。14:67–84. 10.1146/anurev-genom-091212-153515-内政部-公共医学
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