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.2018年6月11日；8(1):8837.
doi:10.1038/s41598-018-27106-9。

镉诱导神经元细胞凋亡是通过Fas/FasL介导的线粒体凋亡信号通路介导的

颜元 1 2, 张亚静 1 2, 赵世文 1 2, 陈杰（音译） 1 2, 杨金龙 1 2, 王涛 1 2, 邹慧（音） 1 2, 王毅（Yi Wang） 1 2, 顾建红 1 2, 刘学忠 1 2, 卞建春 1 2, 刘宗平 三 4
附属公司

镉诱导神经元细胞凋亡是通过Fas/FasL介导的线粒体凋亡信号通路介导的

颜元等。 科学代表. .

摘要

镉（Cd）是一种能够损伤大脑的有毒金属。研究表明，镉可以诱导神经细胞凋亡。CD95/APO-1（Fas）/Fas配体（FasL）信号通路是主要的凋亡途径之一，但该通路在神经元细胞中的作用和调控机制尚不清楚。在这里，我们证明了Fas/FasL系统涉及神经元细胞线粒体凋亡途径的潜在机制。镉可显著激活Fas、FasL、Fas-associated death domain（FADD）和裂解caspase-8的表达。然而，在20µM Cd时，初级大脑皮层神经元中裂解caspase-8的表达降低。重要的是，Cd诱导的细胞凋亡形态学变化和细胞凋亡率的增加被Z-IETD-FMK部分阻断，Z-IETD-FMK是胱天蛋白酶-8的特异性抑制剂。抗FasL抗体抑制Cd介导的细胞凋亡率增加。此外，我们的数据显示，Z-IETD-FMK还阻断了截断BH3相互作用域死亡激动剂（tBID）/BID的增加，B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）/Bcl-2相关X蛋白（Bax）比率和线粒体膜电位（MMP）的降低，细胞色素c的释放，以及caspase-9/3和poly（ADP-核糖）的裂解综上所述，我们的结果表明Fas/FasL介导的线粒体凋亡途径在Cd诱导的神经元凋亡中起着重要作用。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
镉激活神经元细胞中的Fas/FasL凋亡信号通路。用镉（0、5、10或20µM）孵育24小时的大鼠初级大脑皮层神经元和PC12细胞(A类)，或使用Cd（10µM）0、6、12或24小时(B类)用相关抗体进行western blot分析，评估Fas、FasL、FADD和裂解caspase-8蛋白水平。使用Image Lab对Fas、FasL、FADD和裂解caspase-8的印迹进行半定量TM（TM）软件。β-actin作为内部对照。在至少三个独立的实验中观察到了类似的结果。数据表示为相对于对照的平均值±SD（n=3）*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01.
图2
图2
Z-IETD-FMK部分阻止Cd诱导的神经元细胞凋亡形态学改变。用Z-IETD-FMK（40µM）预处理或不预处理原代大鼠大脑皮层神经元和PC12细胞30 min，然后暴露于镉（10μM）24 h。Hoechst 33258染色后，荧光显微镜观察神经元细胞的凋亡形态学变化。凋亡细胞用箭头表示。原始放大倍数为200倍。数据表示为平均值±SD（n=3）**P（P） < 0.01.
图3
图3
Z-IETD-FMK和抗FasL抗体部分抑制Cd诱导的细胞凋亡。(A类)用Z-IETD-FMK（40µM）预处理大鼠原代大脑皮层神经元和PC12细胞30 min，然后用Cd（10µMh.用膜联蛋白V-FITC染色后，用DMI3000 B反相显微镜在200倍放大率下使用FITC和亮场滤光片对神经元细胞进行荧光显微镜分析。PC12细胞用(B类)Z-IETD-FMK（40µM）或(C类)抗FasL（10mg/L）30min后用Cd（10μM）处理24h，annexin V-FITC和PI双重染色，流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率。给出了具有代表性的实验结果。使用早期凋亡（Q4）和晚期凋亡（Q2）细胞计算和分析凋亡率。数据表示为平均值±SD（n=3）**P（P） < 0.01.
图4
图4
Z-IETD-FMK部分阻断Cd诱导的tBID/BID上调，降低神经元细胞中的Bcl-2/Bax比率。在用Cd（10μM）处理24小时之前，用Z-IETD-FMK（40µM）预处理原代大鼠大脑皮层神经元和PC12细胞30分钟(A类)BID和tBID级别以及(B类)使用相关抗体通过western blot测定Bcl-2和Bax水平。BID和tBID级别的斑点(A类)以及Bcl-2和Bax水平(B类)使用图像实验室对初级神经元和PC12细胞进行半定量TM（TM）软件。β-actin作为内部对照。数据表示为平均值±SD（n=3）*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01.
图5
图5
Z-IETK-FMK可阻断镉诱导的神经元细胞线粒体膜电位（MMP）降低。在使用或不使用Z-IETD-FMK（40µM）进行30 min预处理后，用镉（10µM。红色荧光表示JC-1的聚集体形式（聚合物），表示MMP正常。绿色荧光表示JC-1的单体形式，表明MMP降低。用荧光显微镜观察MMP，并显示代表性图像。
图6
图6
Z-IETD-FMK可减弱Cd诱导的神经元细胞内细胞色素c释放、caspase-9/3和PARP裂解。在用镉（10μM）处理24小时之前，用Z-IETD-FMK（40μM）预处理大鼠原代大脑皮层神经元和PC12细胞30分钟(A类)细胞溶质细胞色素c（cyto-CytC）和线粒体细胞色素c（mito-CytC）水平(B类)使用相关抗体通过western blot检测caspase-9、caspase-3和PARP的裂解。环氧合酶IV（COX-IV）和β-肌动蛋白分别用作线粒体和细胞溶质亚组分的内部控制。使用Image Lab对细胞色素c和caspase-9/3以及PARP裂解的印迹进行半定量TM（TM）软件。数据表示为平均值±SD（n=3）**P（P） < 0.01.
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