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.2018年8月；10(8):831-837.
doi:10.1038/s41557-018-0052-5。 Epub 2018年5月28日。

相互正交的吡咯烷基-tRNA合成酶/tRNA对

朱利安·C·W·威利斯 1, 杰森·W·琴 2
附属公司

相互正交的吡咯烷基-tRNA合成酶/tRNA对

朱利安·C·W·威利斯等。 自然化学. 2018年8月.

摘要

将不同的非标准氨基酸（ncAAs）基因编码成细胞合成的蛋白质需要相互正交的氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对。吡咯烷酰-tRNA合成酶/派尔来自mazei甲烷八叠球菌（Mm）的tRNA对已被设计用于整合不同的ncAA，通常被认为是遗传代码扩展的理想对。然而，发现新的aaRS/tRNA对具有MmPylRS/Mm的优势派尔tRNA对和与内源性aaRS/tRNA对和MmPylRS/Mm都正交派尔tRNA对已被证明具有挑战性。这里我们证明了几个ΔNPylRS/派尔tRNACUA公司PylRS缺乏N末端结构域的对是活性的、正交的，并能有效地将ncAAs并入大肠杆菌中。我们创建了新的PylRS/派尔与MmPylRS/Mm相互正交的tRNA对派尔tRNA配对，表明将重组MmPylRS的ncAA特异性的突变移植到新的PylRS中重组其底物特异性。最后，我们展示了不同的PylRS/派尔tRNA-衍生对可以在同一个细胞中发挥作用，解码不同的密码子并结合不同的ncAA。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。本工作中使用的氨基酸的结构。
1，Nε-（（叔丁氧基）羰基）-L-赖氨酸；2Nε-（（（1R，8S）-二环[6.1.0]非4-yn-9-基甲氧基）羰基）-L-赖氨酸，所示外异构体，使用4:1的外/内混合物；三，Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸；4，Nε-（（（2-甲基环丙烷-2-烯-1-基）甲氧基）羰基）-L-赖氨酸。
图2
图2。确定ΔNPylRS/派尔tRNA对在大肠杆菌
（a） 根据存在与D.哈夫宁PylSn在同一基因内(pylSn-pylSc融合类），存在于同一基因组中的单独基因中(pylSn公司类），或完全缺席(ΔpylSn类）。（b）体内琥珀抑制活性测定大肠杆菌携带pBAD-GFP（150TAG）His的DH10B6和相应的pKW PylRS/派尔tRNACUA公司存在和不存在BocK的质粒(1)证明ΔNPylRS的活性/派尔tRNACUA公司对与数的正交性派尔tRNAs关于大肠杆菌氨酰基tRNA合成酶。每个数据点显示形成一个生物复制的三个技术复制的平均值；误差条显示了三个独立生物复制的平均值和SEM。（c） 、（d）、（e）确认特定BocK并入纯化GFPHis6通过嗯PylRS公司/嗯派尔tRNACUA公司,妈妈PylRS公司/妈妈派尔tRNACUA公司和G1号PylRS公司/G1号派尔tRNACUA公司通过电喷雾电离质谱（ESI-MS，预测质量27942 Da，观察质量27942Da）分析，揭示了每个PylRS相对于大肠杆菌tRNA。（c）、（d）、（e）中的ESI-MS实验进行了一次。补充图4提供了原始ESI-MS光谱。
图3
图3。自然PylRS之间的相互正交性/派尔tRNA对。
体内琥珀抑制活性测定大肠杆菌DH10B轴承pBAD GFP（150TAG）His6和相应的pKW PylRS/派尔tRNACUA公司存在和不存在BocK的质粒(1)用同源和非同源证明所示PylRS的活性派尔tRNACUA公司每个数据点显示形成一个生物复制的三个技术复制的平均值；误差条显示了三个独立生物复制的平均值和SEM。
图4
图4。的演变妈妈派伊我tRNA创建相互正交的PylRS/派尔tRNA对。
（a） 进化妈妈派尔tRNA用以消除其功能嗯PylRS同时保留其功能妈妈PylRS，在存在妈妈PylRS之后在有嗯PylRS.（b）的库妈妈派尔tRNA是通过随机或将可变环的长度扩大到4、5或6个随机核苷酸而产生的。（c） 的可变循环序列妈妈派尔tRNA点击已确定。点击是根据识别它们的库进行分组的。第6、8、10、12、15、16、17、18和20个位点也含有G55A突变；点击14、19、22、23和24也包含G55T突变；点击11、13和21也包含G55C突变；hit 7也包含C15T突变。（d） ，（e）体内琥珀抑制活性分析（库N=3和4（d），库N=5和6（e））。每个数据点显示形成一个生物复制的三个技术复制的平均值；误差条显示了三个独立生物复制的平均值和SEM。wt，野生型
图5
图5。设计的活动站点妈妈选择性ncAA合并的PylRS。
（a）体内琥珀抑制活性测定大肠杆菌DH10B轴承pBAD GFP（150TAG）His6和相应的pKW PylRS/派尔tRNACUA公司有无BCNK的质粒(2)证明了嗯PylRS-AF突变为妈妈PylRS促进BCNK使用妈妈每个数据点显示形成一个生物复制的三个技术复制的平均值；误差条显示了三个独立生物复制的平均值和SEM。（b）体内琥珀抑制活性测定大肠杆菌DH10B轴承pBAD GFP（150TAG）His6和相应的pKW PylRS/派尔tRNACUA公司CbzK存在和不存在时的质粒(三)和CypK(4)证明CypK通过嗯PylRS和CbzK的选择性掺入妈妈PylRS-MutRS1。每个数据点显示形成一个生物复制的三个技术复制的平均值；误差条显示了三个独立生物重复的平均值和SEM。
图6
图6。使用相互正交的PylRS编码不同的ncAA/派尔tRNA对。
（a） GFPHis公司6纯化自大肠杆菌包含GFP（150TAG）His6,嗯PylRS公司/嗯派尔tRNA加州大学联合会和妈妈PylRS-MutRS1/妈妈派尔tRNA（6）CUA公司SDS-PAGE分析。进行了两个独立的实验，结果相似。（b） GFPHis的电喷雾电离质谱6纯化自大肠杆菌包含GFP（150TAG）His6,嗯PylRS公司/嗯派尔tRNA加州大学联合会,妈妈PylRS-MutRS1/妈妈派尔tRNA（6）CUA公司同时存在CbzK和CypK。峰值对应于CbzK掺入（预测质量27976 Da，观测质量27975 Da）。进行了一次ESI-MS。（c） GFPHis公司6纯化自大肠杆菌包含GFP（150TAG）His6,嗯PylRS公司/嗯派尔tRNACUA公司,妈妈PylRS-MutRS1/妈妈派尔tRNA（6）UACU（通用汽车控制单元）SDS-PAGE分析。进行了两个独立的实验，结果相似。（d） GFPHis的电喷雾电离质谱法6纯化自大肠杆菌含有GFP（150TAG）His6,嗯PylRS公司/嗯派尔tRNACUA公司,妈妈PylRS-MutRS1/妈妈派尔tRNA（6）阿联酋联合酋长国同时存在CbzK和CypK。峰值对应于CypK掺入（预测质量27952 Da，观测质量27951 Da）。进行了一次ESI-MS。（e） GST-CaM纯化大肠杆菌含有核糖-Q1，o-GST-CaM（1TAG，40AGGA），嗯PylRS公司/嗯派尔tRNA加州大学联合会,妈妈PylRS-MutRS1/妈妈派尔tRNA（6）CUA公司在有无指定ncAA的情况下生长。样品通过SDS-PAGE进行分析。进行了两个独立的实验，结果相似。
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中的注释

  • 优化正交性。
    Ngai WSC，Chen公关。 Ngai WSC等人。 自然化学。2018年8月；10(8):802-803. doi:10.1038/s41557-018-0115-7。 自然化学。2018 PMID：30030532 没有可用的摘要。

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