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.2018年5月；192(2):151-164.
doi:10.1111/cei.13104。 Epub 2018年2月20日。

活化白细胞粘附分子（ALCAM/CD166）调节食物过敏小鼠模型的T细胞反应

Y S金 1, M N Kim先生 1, K E Lee公司 1, J Y Hong（J Y洪） 1, M S哦 1, S Y金 1, K W金 1, M H Sohn先生 1
附属公司

活化白细胞粘附分子（ALCAM/CD166）调节食物过敏小鼠模型的T细胞反应

Y S金等。 临床实验免疫学. 2018年5月.

摘要

食物过敏是一个主要的公共卫生问题。研究表明，抗原提呈细胞表面活化的白细胞粘附分子（ALCAM/CD166）与共同刺激分子CD6之间的长期相互作用影响免疫反应。然而，目前还没有关于ALCAM在食物过敏中的作用的研究。因此，我们旨在利用ALCAM缺乏的小鼠来鉴定ALCAM对卵清蛋白（OVA）诱导的食物过敏的作用。野生型（WT）和ALCAM缺陷（ALCAM-/-)小鼠经腹腔注射和口服OVA致敏。处死小鼠，分析与食物过敏和辅助性T细胞2型（Th2）免疫反应相关的参数。OVA激发的WT小鼠的ALCAM血清水平升高，mRNA表达降低。OVA激发的WT小鼠的血清免疫球蛋白（Ig）E水平、Th2细胞因子mRNA和组织学损伤高于对照小鼠，而ALCAM组的这些水平减弱-/-老鼠。总细胞的T细胞增殖，CD3+CD4细胞+OVA激发的ALCAM中免疫组织中的T细胞和活化T细胞减少-/-老鼠。抗CD6抗体降低了共同培养的T细胞和树突状细胞（DC）的增殖。此外，通过过继转移OVA脉冲ALCAM致敏的WT小鼠-/-BM衍生DC表现出免疫反应降低。最后，食物过敏儿童的血清ALCAM水平高于对照组。在本研究中，食物过敏诱导的WT小鼠和食物过敏儿童的血清ALCAM水平升高。此外，OVA激发的ALCAM的免疫反应和T细胞活化减弱-/-老鼠。这些结果表明，ALCAM通过影响T细胞活化来调节食物过敏。

关键词：ALCAM；CD166；活化白细胞粘附分子；食物过敏。

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数字

图1
图1
卵清蛋白（OVA）激发野生型（WT）小鼠的活化白细胞粘附分子（ALCAM）水平发生改变。（a） 诱导小鼠食物过敏的实验方案。用50µg OVA和10µg霍乱毒素（CT）致敏小鼠，并用50 mg OVA攻击小鼠。在最后一次激发后测量临床评分（b）、腹泻评分（c）和核心体温（d）。（e） 小鼠血清中OVA特异性免疫球蛋白（Ig）e水平。（f） 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清ALCAM水平。（g） 通过实时聚合酶链反应测量小肠中的ALCAM mRNA。（h） Western blotting法测定血清和小肠中ALCAM蛋白水平。数据代表三个独立实验(n个=每组3-4）*P<0·05, **P<0·01与磷酸盐缓冲盐水（PBS）激发对照小鼠。[彩色图形可在以下位置查看http://wileyonlinelibrary.com]
图2
图2
活化白细胞粘附分子（ALCAM）调节食物过敏小鼠模型的免疫反应。用50µg卵清蛋白（OVA）和10µg霍乱毒素（CT）致敏小鼠，并用50 mg OVA激发。在最后一次激发后，在OVA激发的野生型（WT）和ALCAM中测量临床评分（a）、腹泻评分（b）和核心温度（c）–/–小鼠（数据代表三个独立实验，n个=每组4个）。（d） 小鼠小肠中T辅助因子2型（Th2）细胞因子[IL-4、IL-5和IL-13]的mRNA表达。（e） 用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各组小鼠血清中总免疫球蛋白（Ig）e水平和OVA特异性IgE的光密度值(n个=每组5份），每份样品一式三份。小肠组织学观察（f）和损伤评分（代表三个独立实验的数据，n个=每组4）（g）。（h） 通过电子显微镜（EM）对肠紧密连接的形态学观察**P<0·01[磷酸盐缓冲盐（PBS）与WT/OVA）]；## P<0·01（WT/OVA）与美国资产负债管理委员会–/–/OVA）。放大倍数：f，×200；i、 ×50 000。[彩色图形可在以下位置查看http://wileyonlinelibrary.com]
图3
图3
活化的白细胞粘附分子（ALCAM）影响T细胞增殖。从小鼠中取出脾脏和肠系膜淋巴结（mLNs），并从这些组织中分离细胞。脾和mLNs的总细胞在缺乏（对照；CON）或存在卵清蛋白（OVA）的情况下培养5天。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析评估T细胞增殖。在脾细胞培养上清液中测量释放的T辅助因子2型（Th2）细胞因子[白细胞介素（IL）-4、IL‐5和IL‐13]。（a） 脾（左）和mLN（右）中的总细胞增殖。（b） 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估脾细胞培养基上清液中的Th2细胞因子水平。三口井的平均值±标准偏差；n个=每组4个，代表三个独立实验的数据**P<0·01（CON与WT/OVA）；## P<0·01（WT/OVA）与美国资产负债管理委员会–/–/OVA）。
图4
图4
活化的白细胞粘附分子（ALCAM）影响活化的T细胞群。来自脾脏、肠系膜淋巴结（mLNs）和小肠（空肠）的单个细胞用CD3和CD4门控CD4+流式细胞术检测活化T细胞的T细胞群或CD4、CD44和CD62配体（CD62L）。（a） CD3+CD4细胞+卵清蛋白（OVA）激发野生型（WT）和ALCAM的脾细胞、mLN细胞和小肠固有层单核细胞中的T细胞群–/–老鼠。（b） OVA激发的WT和ALCAM淋巴组织中的活化T细胞–/–用CD4门控法测量小鼠+CD44细胞高的CD62L型低的.（c）CD4的数量+小鼠淋巴组织中的T细胞。（d） 小鼠淋巴组织中效应T细胞的数量。流式细胞术的数据在三个独立实验中具有再现性，并且三份小瓶的平均值±标准偏差，n个=每组4，代表（c）和（d）三个独立实验的数据**P<0·01（控制与WT/OVA）；# P<0·05,## P<0·01（WT/OVA）与美国资产负债管理委员会–/–/OVA）。
图5
图5
CD6缺乏会减少共培养细胞的增殖。野生型（WT）(n个=4）和活化白细胞粘附分子（ALCAM）–/–(n个=4）小鼠用卵清蛋白（OVA）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）致敏两次，间隔2周。从脾脏中分离单个细胞以获得T细胞和树突状细胞（DC）。接下来，混合T细胞和WT DC或ALCAM–/–DC与抗CD6抗体（αCD6）或免疫球蛋白（Ig）G抗体作为对照，在96孔圆底培养板中共培养5天。（a） 通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法测量共培养细胞的增殖。（b） –（d）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定培养上清液中T辅助因子2型（Th2）细胞因子水平。数据为三口井的平均值±标准偏差**P<0·01（含WT DC的WT T细胞与含有WT DC和αCD6的WT T细胞）；## P<0·01（含WT DC的WT T细胞与使用ALCAM的WT T细胞–/–DC）。
图6
图6
活化白细胞粘附分子（ALCAM）–/–骨髓来源的树突状细胞（BMDC）减轻野生型（WT）小鼠的免疫反应。分离骨髓细胞，通过从WT和ALCAM中分化这些细胞获得DC–/–老鼠(n个 = 4). WT小鼠接受幼稚或卵清蛋白（OVA）脉冲WT或ALCAM–/–DC两次，间隔2周腹腔注射霍乱毒素（CT）。两周后，每隔一天用OVA或磷酸盐缓冲盐水（PBS）对小鼠进行六次口服激发。（a） 小鼠的腹泻评分。（b） 最后一次挑战时直接估计的堆芯温度。（c） 根据实时聚合酶链反应（PCR），小鼠小肠中辅助T细胞因子2型（Th2）mRNA的表达水平。（d） 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量血清OVA特异性免疫球蛋白（IgE）。（e） 使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液测量脾脏和肠系膜淋巴结（mLNs）的细胞增殖。（f） 小鼠小肠的组织学检查（苏木精和伊红染色）；n个=每组和总计3人N个 = 36. **P<0·01（原始WT BMDC与OVA‐脉冲WT BMDC）；## P<0·01（OVA脉冲WT BMDC与OVA脉冲ALCAM–/–BMDC）。放大倍数×200。[彩色图形可在以下位置查看http://wileyonlinelibrary.com]
图7
图7
食物过敏儿童的血清活化白细胞粘附分子（ALCAM）水平升高(n个=53）和健康对照受试者(n个=90）。海盗图表示ALCAM水平的分布，水平平均线和方框表示95%的置信区间**P<0·01.
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