RNA核富集序列的高通量鉴定
摘要
数字
实验概述。 最左边 ：寡核苷酸池设计。 双链DNA（dsDNA）寡核苷酸是通过计算扫描110 nt窗口中38个亲本lncRNA转录物（表EV1）设计的，序列寡核苷酸之间间隔10 nt。 这些lncRNA衍生序列（灰色）附加了独特的条形码和通用的引物结合位点，产生了11969个153 bp的寡核苷酸（表EV1）。 lncRNA中的垂直线表示剪接连接。 从左数第二个 ：示意图总结了每个寡核苷酸的设计。 从右数第二个 ：记者设计。 将寡核苷酸池克隆到报告质粒中，作为 fsSox2型 （minCMV，最小CMV启动子；pA，多聚腺苷酸化序列）。 最右边 ：MPRA工作流。 这个 fsSox2型 ●将寡核苷酸报告池瞬时转染到HeLa细胞中。 在表达48小时后，收集并分离细胞以分离细胞核，并通过靶向RNA测序量化每个寡核苷酸的核富集。 来自未分离细胞的匹配全细胞裂解物作为对照。 读取映射和规范化。 读取的前10 nt与条形码序列之间的完美匹配用于“映射”读取。 为了保证映射过程的健壮性，我们在条形码上游的90个碱基对中允许不超过两个不匹配（请参阅我们的分析包中的“mapReads”函数-请参阅代码可用性部分）。 使用“normCounts”表将计数标准化为库大小（请参阅分析包和GEO数据，请参阅代码和数据可用性部分）。 每个核苷酸的计数基于每个寡核苷酸的标准化计数进行建模。 当核苷酸“A”与寡核苷酸i重叠时 1 ，我 2 ，我 三 和我 4 ，该核苷酸的计数由每个寡核苷酸（i）的计数中位数建模 1 –i 4 ; 请参阅我们的分析管道中的“modelNucCounts”函数）。 然后使用核苷酸计数通过以下方式推断差异区域：（1）：找到候选区域并为其中的每一个分配汇总统计数据；接下来（2）：通过排列样本标签生成空候选区域并使用它们分配经验 P（P） 第1步对候选区域的价值，以确定重要区域。 差分区域调用可以正确识别 马拉特1 实线：核（红色）和全细胞（灰色）组分中的每核苷酸丰度，沿着 马拉特1 转录本，基于包含该核苷酸的所有寡核苷酸的聚集行为（阴影区域：±SD，六个生物复制品的中位数）。
寡核苷酸在克隆质粒池中的分布。 （i） 对于几个不同的寡聚体，显示均匀计数的单峰表示极少量的累积，以及（ii）整个寡聚物表示（零计数时的小起伏）。 核浓缩 NEAT1公司 , GAPDH、， 和 SNHG5系列 由每个生物复制中的qRT-PCR测定（左）（误差条：±SD）。 六个重复组中位数±SD的核富集。 使用材料和方法中概述的方案，与GFP质粒共转染的HeLa细胞的转染效率。 每个样品中的初始寡聚物回收率均大于70%。 平均而言，只有0.2%的寡聚物（即？5寡聚体）未在核馏分样品中检测到，而在总（全细胞裂解物）样品中未检测到？0.4%（即？50寡聚体内）。 条形图显示了技术复制品（TR）和生物复制品（BR）分离的核（N）和总分数（T）不同样品的所有读数的绘图百分比。 显示同一寡核苷酸计数之间复制间差异的方框图。 检测到的技术差异较低，这表明技术复制品之间的计数差异较小。 实心水平线是中间值，而下铰链和上铰链对应于第一和第三个四分位（25 第个 和75 第个 百分位数）。 上部晶须从铰链延伸至最大值，距离铰链不超过1.5×IQR。 较低的晶须从铰链延伸至铰链最大1.5×IQR的最小值。 晶须末端以外的数据为离群值，单独绘制。 人和小鼠中与人RRD、小鼠RRD和其他核苷酸重叠的核苷酸的CDF图 FIRRE公司 基因座。 类似于 马拉特1 M区和E区，MPRNA重述了已知RNA核保留元件RRD的功能 FIRRE公司 轨迹。 由于实验是在人类HeLa细胞中进行的 FIRRE公司 RRD是核浓缩的，而小鼠 FIRRE公司 RRD不影响 fsSox2型 ( P（P） 值：Mann–Whitney检验人类FIRRE转录物中RRD核苷酸与人类和小鼠FIRRE抄本中其他非RRD核苷酸的比较）。 差异区域调用正确识别的核保留元素 FIRRE公司 实线：核（红色）和全细胞（灰色）部分的每核苷酸丰度，沿 FIRRE公司 转录物，基于包含该核苷酸的所有寡核苷酸的聚集行为（阴影区域±SD，六个生物复制的中间基）。
A–E 识别具有不同亚细胞定位模式的lncRNAs中的差异区域（DR）。 数据如图1E所示。 已建立的亚细胞定位模式范围从（A），占据单个突出的核焦点( ANRIL公司， FISH类别1）至（E），表现为弥漫的，主要是细胞溶质模式( 编号_024412 ，鱼类5类； 卡维利 等 , 2015). F类 每10 kb lncRNA序列平铺发现的DR数量对于每个FISH类都是相似的。 G公司 DRs比大多数lncRNA序列更保守。 比较DR中核苷酸的相位坐标分数的箱线图( 红色 )寡核苷酸池中的所有其他核苷酸( 灰色 ). P（P） 值：Mann–Whitney试验。 实心水平线是中间值，而下铰链和上铰链对应于第一和第三个四分位（25 第个 和75 第个 百分位数）。 上部晶须从铰链延伸至最大值，距离铰链不超过1.5×IQR（其中IQR是四分位范围内）。 较低的晶须从铰链延伸至铰链最大1.5×IQR的最小值。 晶须末端以外的数据为离群值，单独绘制。
A类 在DRs中丰富的新57 nt基序的位置权重矩阵（PWM） XIST公司 ( E类 值<0.05）。 B 在整个 XIST公司 基因座。 C类 多序列比对 XIST公司 图案( 有色核苷酸 )在 XIST公司 DR。相邻序列用灰色表示。 D类 21种不同lncRNAs的DR中富集的新型富C 15 nt基序的PWM( E类 值<0.05）。 E类 这一主题在整个 马拉特1 轨迹。 F类 该图案不同实例的多重序列比对( 有色核苷酸 )它们出现在所示lncRNAs的DR中。 G公司 与MPRNA中的所有其他寡核苷酸相比，具有图2A-F和附录图S2中描述的新基序的寡核苷酸在核部分中显著富集。 P（P） 值：Mann–Whitney试验。 实心水平线是中间值，而下铰链和上铰链对应于第一和第三个四分位（25 第个 和75 第个 百分位数）。 上部晶须从铰链延伸至最大值，距离铰链不超过1.5×IQR。 较低的晶须从铰链延伸至铰链最大1.5×IQR的最小值。 晶须末端以外的数据为离群值，单独绘制。 H、 我 新的核富集基序影响内源性人类转录物的定位。 与HeLa和A549细胞中所有其他转录物相比，人类mRNA和lncRNA转录物的核富集与发现的基序至少出现一次的比较（ENCODE项目联盟，2012年）。 P（P） 值：Mann–Whitney检验（与所有其他lincRNA相比，具有至少一个基序出现的lincRNA；与所有其他mRNA相比，至少具有一个基模出现的mRNA）。 实心水平线是中位数，而下铰链和上铰链对应于第一个和第三个四分位数（25 第个 和75 第个 百分位数）。 上部晶须从铰链延伸至最大值，距离铰链不超过1.5×IQR。 较低的晶须从铰链延伸至铰链最大1.5×IQR的最小值。 晶须末端以外的数据为离群值，单独绘制。
代表 XIST公司 lncRNA的富C基序区和新的差异区 图1 和 XIST公司 在（B–D）中进行了检查。 数据如图1E所示。 smFISH实验概述和示例。 fsSox2型 将报告结构与单个小基序和长DR融合。典型的smRNA‐FISH图像：( 左边 )未修改的 fsSox2型 记者( 中间的 ) fsSox2型 熔接成三串列 XIST公司 图案，以及( 正确的 ) fsSox2型 融合到富C基序的三个串联实例中（比例尺=20μm，蓝色：Hoechst 33342）。 典型的smRNA-FISH图像( 左边 )未修改的 fsSox2型 , 马拉特1 区域M( 左数第二） , 图1 灾难恢复( 右数第二）， 和 XIST公司 灾难恢复( 右侧） . 核定位的smFISH量化 fsSox2型 与指示基序和DR融合的报告构建体( P（P） 值：Mann–Whitney试验）。 实心水平线是中间值，而下铰链和上铰链对应于第一和第三个四分位（25 第个 和75 第个 百分位数）。 上部晶须从铰链延伸至最大值，距离铰链不超过1.5×IQR。 下须从铰链延伸到最小值，最大为铰链的1.5×IQR。 晶须末端以外的数据为离群值，单独绘制。
中的注释
-
没有出路：当RNA元素促进核保留时。 EMBO J.2018年3月15日； 37（6）：e99123。 doi:10.15252/embj.201899123。 Epub 2018年2月27日。 EMBO J.2018年。 PMID： 29487065 免费PMC文章。
类似文章
-
长非编码RNA：生物体功能的分子模式。 生物化学年度收益。 2020年6月20日； 89:283-308. doi:10.1146/annurev-biochem-062917-012708。 生物化学年度收益。 2020. PMID： 32569523 审查。 -
核分馏揭示了数千个与活性基因相邻的染色质连接的非编码RNA。 Cell Rep.2015年8月18日； 12(7):1089-98. doi:10.1016/j.celrep.2015.07.033。 Epub 2015年8月6日。 细胞报告2015。 PMID： 26257179 免费PMC文章。 -
古代排除的转座因子促进人类长非编码RNA的核富集。 基因组研究2019年2月； 29(2):208-222. doi:10.1101/gr.229922.117。 Epub 2018年12月26日。 2019年基因组研究。 PMID： 30587508 免费PMC文章。 -
卡波西肉瘤相关疱疹病毒潜伏转录长非编码RNA反义的表达。 J维罗尔。 2017年1月31日； 91（4）：e01698-16。 doi:10.1128/JVI.01698-16。 2017年2月15日印刷。 J维罗尔。 2017 PMID： 27928018 免费PMC文章。 -
长非编码RNA：基因调控和核组织之间的新兴联系。 趋势细胞生物学。 2014年11月； 24(11):651-63. doi:10.1016/j.tcb.2014.08.009。 Epub 2014年10月23日。 趋势细胞生物学。 2014 PMID： 25441720 免费PMC文章。 审查。
引用人
-
RNA定位于线粒体机制和功能。 RNA。 2024年5月16日； 30(6):597-608. doi:10.1261/rna.07999.124。 RNA。 2024 PMID： 38448244 免费PMC文章。 审查。 -
LncLocFormer：一种基于Transformer的深度学习模型，用于使用定位特异性注意机制进行多标记lncRNA亚细胞定位预测。 生物信息学。 2023年12月1日； 39（12）：btad752。 doi:10.1093/bioinformatics/btad752。 生物信息学。 2023 PMID： 38109668 免费PMC文章。 -
mRNA核输出：mRNA身份特征如何区分功能RNA和垃圾转录物。 RNA生物学。 2024年1月； 21(1):1-12. doi:10.1080/15476286.2023.2293339。 Epub 2023 12月13日。 RNA生物学。 2024 PMID： 38091265 免费PMC文章。 审查。 -
外显体转移的LINC00668通过促进炎症性肠病中NETs的形成促进血栓形成。 高级科学（Weinh）。 2023年10月； 10（28）：e2300560。 doi:10.1002/advs.20230560。 Epub 2023年8月17日。 高级科学（Weinh）。 2023 PMID： 37590310 免费PMC文章。 -
血压基因调节变体的系统特征。 细胞基因组。 2023年5月24日； 3(7):100330. doi:10.1016/j.xgen.2023.100330。 eCollection 2023年7月12日。 细胞基因组。 2023 PMID： 37492106 免费PMC文章。
