Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork

doi:10.1016/j.bpj.2017.10.026

.2017年12月19日；113(12):2609-2620.

doi:10.1016/j.bpj.2017.10.026。

DNA复制叉纳米组装高活性组AT-Hook 2蛋白

娜塔莉·克拉恩¹, 马库斯·迈耶¹, Vu收件人¹, 埃文·普·布伊¹, 凯文·麦克莱尼², 乔·奥尼尔¹, 肖恩·麦肯纳^三, Trushar R Patel公司⁴, 约格·斯特菲尔德⁵

附属公司

¹加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系。
²加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系；加拿大曼尼托巴省温尼伯市曼尼托巴大学曼尼托巴材料研究所。
^三加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学马尼托巴省材料研究所；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学生物化学和医学遗传学系。
⁴加拿大阿尔伯塔省莱斯布里奇市莱斯布里奇大学化学与生物化学系阿尔伯塔RNA研究训练所；加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学医学和牙科学院发现实验室；加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市卡尔加里大学卡明医学院微生物、免疫学和传染病系。电子地址：trushar.patel@uleth.ca。
⁵加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学微生物系。电子地址：joerg.stetefeld@umanitoba.ca。

PMID： 29262356
预防性维修识别码： PMC5771026
内政部： 2016年10月10日/j.bpj.2017.10.026

用DNA复制叉纳米组装高迁移率AT钩2族蛋白

娜塔莉·克拉恩等。生物物理学J. 2017.

.2017年12月19日；113(12):2609-2620.

doi:10.1016/j.bpj.2017.10.026。

作者

附属公司

¹加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系。
²加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学马尼托巴省材料研究所。
^三加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学化学系；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学马尼托巴省材料研究所；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学生物化学和医学遗传学系。
⁴加拿大阿尔伯塔省莱思布里奇市莱思布里奇大学化学和生物化学系阿尔伯塔RNA研究与培训学院；加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学医学和牙科学院发现实验室；加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市卡尔加里大学卡明医学院微生物、免疫学和传染病系。电子地址：trushar.patel@uleth.ca。
⁵加拿大曼尼托巴省温尼伯市曼尼托巴大学化学系；加拿大曼尼托巴省温尼伯市马尼托巴大学微生物系。电子地址：joerg.stetefeld@umanitoba.ca。

PMID： 29262356
预防性维修识别码： PMC5771026
内政部： 2016年10月10日/j.bpj.2017.10.026

摘要

高迁移率族AT-hook 2（HMGA2）蛋白由三个AT-hook结构域组成。HMGA2在胚胎干细胞和癌细胞中均高水平表达，与复制叉（RF）相互作用并稳定复制叉，导致细胞增殖率升高。在这项研究中，我们证明HMGA2敲低可降低细胞增殖。为了了解HMGA2和RFs之间相互作用所需的特征，我们使用一系列综合生物物理技术研究了HMGA2的溶液结构，包括游离的和与RFs复合的HMGA2。圆二色谱和核磁共振实验证实了未结合HMGA2的无序状态。动态光散射和沉降速度实验表明HMGA2和RF在溶液中呈单分散，并形成等摩尔络合物。小角度x射线散射研究表明，HMGA2以并排的方向与RF结合，其中3个AT-hook作为夹子包裹扭曲的RF。因此，我们的数据提供了HMGA2如何与停滞的RF相互作用以及该过程的功能的见解。

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数字

图1
(A类)这里给出了人类HMGA2的氨基酸序列示意图，突出了AT-hook结构域。(B类)这里给出的是转染后48小时使用抗Tubulin（对照）和抗HMGA2抗体的HMGA2敲除的Western blot。(C类)在96小时内每隔24小时监测一次HMGA2敲除对HEK293T细胞活性的影响。转染HMGA2 siRNA后，观察到活性显著下降。数据点显示为八个测量值的平均值，误差条与SD相对应(D类)此处显示纯化HMGA2的考马斯染色SDS-PAGE。要查看此图的颜色，请联机。

图2
(A类)此处显示HMGA2的洗脱曲线(珊瑚)，射频(*蓝绿色*)、和复杂(*海绿色*)分别来自Superdex 75 10/300 GL、HiLoad 16/600 Superdex-75和Superdex75 10/300 CL SEC色谱柱，表明单个成分和复合物的纯度。(B类)此处给出的EMSA表示与HMGA2（0-3）相互作用时RF（200 nM）迁移较慢μM） ●●●●。(C类)这里显示的是HMGA2的结合曲线，其射频拟合到修改的希尔方程。使用密度测定法确定数据点，并显示为三次独立测量的平均值（740±50 nM）。要查看此图的颜色，请转到联机。

图3
(A类)这里给出的是水动力半径(*R（右）*_小时)分配和(C类)沉降系数(秒_20,w个)HMGA2的分布(珊瑚)，射频(青色)、和复杂(*海绿色*)浓度为1 mg/mL，表明样品呈单分散状态。(B类)*R（右）*_小时HMGA2和RF在多种浓度（1–10 mg/mL，*底部x轴*)对于0.2和1 mg/mL之间的络合物(*顶部x轴*). 垂直误差条指示五次测量的SD。(D类)水中的Svedberg系数(秒_20,w个)以多个浓度（0.2–2 mg/mL）绘制每个样品的曲线，垂直误差条表示多次扫描的SE。该图显示了实验条件下所有样品的浓度独立性。要查看此图的颜色，请联机。

图4
根据程序RONN（52），HMGA2的整个序列被预测为无序。要查看此图的颜色，请联机。

图5
(A类)这里给出了HMGA2、RF和复合体的远紫外CD光谱，显示为三次测量的平均值，表明HMGA2无序，并证实了RF的形成。参考射频（56）(*黑色虚线*)光谱覆盖在实验射频上(*蓝绿色*)用于比较。(B类)这里显示的是¹⁵游离HMGA2的N HSQC光谱叠加(珊瑚)HMGA2与RF复合(绿色)表明HMGA2在与RF相互作用时发生构象变化。(C类)这里给出的是HMGA2的合并SAXS数据(珊瑚)，射频(*蓝绿色*)、和复杂(海绿)从多种浓度获得。相应的(D类)Kratky图表明HMGA2(珊瑚)是一种紊乱的蛋白质，而RF(*蓝绿色*)是结构化的(*上部面板*). 复合物的理论Kratky分析(紫色)与实验分析明显不同(*海绿色*)表明HMGA2在与RF相互作用时发生构象变化(*下部面板*). (E类)这里给出的是*P（P）*(第页)HMGA2、RF和复合体的功能（与C类和D类)概述分子及其多域性质D类_最大值。若要查看此数字的颜色，请联机。

图6
这里显示的是低分辨率结构(A类)射频(*扩展形状*)和(B类)DAMMIN测定的络合物。(C类)MONSA建模区分HMGA2(珊瑚)来自RF(蓝色)在复合体中，表明HMGA2以并排的方向与RF相互作用。要查看此图的颜色，请联机。

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