A Mechanistic Explanation for the Regioselectivity of Nonenzymatic RNA Primer Extension

doi:10.1021/jacs.7b08784

.2017年11月22日；139(46):16741-16747.

doi:10.1021/jacs.7b08784。 Epub 2017年11月7日。

非酶RNA引物延伸区域选择性的机理解释

君士坦丁·朱尔修¹, 李丽¹, 德里克·奥弗拉赫蒂¹, Chun Pong Tam村¹, 杰克·W·绍斯塔克¹

附属公司

PMID： 29112424
PMCID公司： PMC6326530型
内政部： 10.1021/jacs.7b08784

非酶RNA引物延伸区域选择性的机理解释

君士坦丁·朱尔修等。美国化学会志. 2017.

.2017年11月22日；139(46):16741-16747.

doi:10.1021/jacs.7b08784。 Epub 2017年11月7日。

作者

君士坦丁·朱尔修¹, 李丽¹, 德里克·奥弗拉赫蒂¹, Chun Pong Tam村¹, 杰克·W·绍斯塔克¹

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院霍华德·休斯医学院分子生物学系和计算与集成生物学中心，邮编：02114。

PMID： 29112424
PMCID公司： PMC6326530型
内政部： 10.1021/jacs.7b08784

摘要

非酶RNA引物延伸的工作模型可以说明益生元化学是如何转化为生物学的。所有目前已知的非酶RNA引物延伸的实验重建都产生了2'-5'和3'-5'核苷酸间连接的混合物。虽然长期以来被视为一个主要问题，但反应区域选择性差的原因尚不清楚。我们使用不同的离开基团、碱基和模板序列的组合来揭示产生3'-5'核苷酸间键选择性形成的因素。我们发现快速高产率的反应选择性地形成3’-5’键。此外，在所有具有高3'-5'区域选择性的情况下，在延伸位点和相邻的下游位置观察到RNA单体和模板之间的Watson-Crick碱基配对。不匹配的碱基和其他因素会干扰咪唑啉桥联中间体的几何结构，从而降低反应的速率和区域选择性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
测定2′-5′的百分比寡核苷酸中的连接。（a）模板化RNA引物延伸形成2′-5′连锁（氰基途径）或3′-5′连锁（品红途径）。内切核糖核酸酶选择性裂解3′-5′联系；NB代表碱基；L代表咪唑离开组。（b）顶部：用于RNase T1测定，如果箭头所示的红色键是3′-5′键它将被酶裂解。底部：酶消化物的PAGE分析证实延伸引物在任何浓度下都不会被酶裂解测试，而3′-5′连接在核糖核酸酶浓度高。标准是指综合获得的3′-磷酸底漆。测定动态范围和详细实验条件可以在支持信息（c）顶部：RNase中使用的引物-模板双链体的序列化验，标记与面板（b）相同；底部：PAGE分析RNase A分析，类似于面板（b）底部。

图2
核酸酶对区域选择性的影响。酶消化是对嘌呤单体使用RNase A，对嘧啶单体。百分比代表比例2′-5′键的四个键形成并获得独立实验。

图3
离开群体对区域选择性的影响。酶消化是用RNase A进行的。百分比表示比例2′-5′连杆的独立实验。

图4
不匹配项导致区域选择性降低。（a）核糖核酸酶a是用于嘌呤单体的酶促消化，以及RNase T1用于嘧啶单体。核苷酸N₁和N个₂形成标准碱基对；X和N₂形式失误。L代表2-氨基咪唑离开基团。百分比表示形成的2′-5′连杆的比例从四个独立的实验中获得。无扩展产品在²在模板上添加U单体胞嘧啶残留*该值是从三个独立的实验中获得的。

图5
复制最后一个核苷酸会产生骨架异质性。用核糖核酸酶对G和A单体进行酶消化A；对于C单体，使用RNase T1。百分比代表得到了形成的2′-5′连杆的比例来自四个独立实验。

图6
（a）下游粘合剂提高了区域选择性。在所有情况下RNase A用于酶消化。百分比代表反应中形成2′-5′键的比例使用左侧的A单体和G单体在数值上方。这些值是从四个独立的实验。（b）修剪辅助底漆延伸。使用了RNase T1用于U和C单体的酶消化，而RNase A与A单体一起使用。百分比代表比例2′-5′连杆的独立实验。引物延伸的电泳图谱使用2-AImpU时的反应和后续酶消化与2-AImpAGC一起使用。控制是指省略酶；标准是指3′-磷酸盐底漆。（c）底漆模板摆动对适度影响区域选择性。中的虚线主模板双工表示在G和U。电泳图显示引物延伸的结果和核糖核酸酶A酶消化。控制是指省略酶；标准是指3′-磷酸底漆。百分比值表示形成的2′-5′连杆的比例并从四个独立的实验中获得。

图7
A 2′-5′模板中的链接是不可遗传的。电泳图显示了引物延伸RNase的结果酶消化。控制是指省略酶；标准指3′-磷酸底漆。百分比值表示得到了2′-5′键的形成比例来自四个独立的重复。

图8
咪唑啉桥联二聚体可能通过绑定到模板Watson–两个相邻位点的Crick碱基对。咪唑啉核心以红色突出显示。

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