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.2017年12月；13(12):1261-1266.
doi:10.1038/nchembio.2497。 Epub 2017年10月16日。

晶体结构揭示了吡咯烷酰-tRNA合成酶的一个难以捉摸的功能域

铃木达基 1, 科尔温·米勒 1, 李涛郭 1, 乔安妮·M·L·何 1, 大卫·I·布莱森 2, Yane-Shih Wang（音译） 1, 大卫·R·刘 2 三 4, 迪特尔·索尔 1 5
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晶体结构揭示了吡咯烷酰-tRNA合成酶的一个难以捉摸的功能域

铃木达基等。 自然化学生物. 2017年12月.

摘要

吡咯烷酰-tRNA合成酶（PylRS）是利用非经典氨基酸扩展遗传密码的主要工具，但其结构和功能尚未完全了解。在这里，我们描述了这种独特的酶与tRNA复合物中先前未表征的必需N末端结构域的晶体结构派尔这种结构解释了为什么PylRS在从细菌到人类的广泛生物中保持正交。该结构也说明了为什么tRNA派尔PylRS的识别是反密码子独立的：反密码子不与酶接触。然后，使用标准的微生物培养设备，我们建立了一种新的实验室进化方法——一种与先前开发的噬菌体辅助连续进化相对应的非连续进化方法。通过这种方法，我们进化出具有增强活性和氨基酸特异性的新型PylRS变体。最后，我们使用一个进化的PylRS变体来确定其N末端结构域，并展示其突变如何在非标准氨基酸的遗传编码中提高PylRS活性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性金融利益

作者们宣布了相互竞争的经济利益：论文的在线版本中附有详细信息。

竞争性财务利益

作者打算在PANCE系统上申请专利。

数字

图1
图1。结合tRNA的野生型和PANCE衍生PylRS变体的晶体结构派尔
(一)MmPylRS NTD•tRNA的叠加派尔复合物（青色；本研究）D.哈夫宁PylRS CTD•tRNA派尔复杂（灰色；PDB ID:2ZNI）。这个马赛先生和D.哈夫宁tRNA派尔物种具有相同的三叶草二级结构，但32%的基部不同。70%的tRNA（nt 1–7、26–44、49–72）的磷原子包含tRNA的受体茎、T茎/环和反密码子茎/环派尔)用于叠加（rmsd=4.04Ω）。锌2+表示为橙色球体。PylRS CTD由催化（黄色）和tRNA结合（蓝色）域组成。Pyl识别循环以粉红色表示。连接NTD到CTD的连接器的可能路径由黑色虚线显示；根据PylRS的来源，连接物在63-157个氨基酸之间变化(b条)MmPylRS NTD和tRNA之间接口的特写视图派尔. (c（c）)PANCE相关PylRS变异体32A NTD和tRNA之间接口的特写视图派尔将chPylRS NTD中进化出的突变移植到MmPylRS NDD中以进行结构测定。PANCE相关残基表示为球形，而与每个PylRS变体的NTD相互作用的核苷酸表示为棒状。PylRS残基和tRNA核苷酸之间的极性相互作用用黑色虚线表示。相互作用距离以Å为单位。
图2
图2。PylRS对tRNA特异性的结构基础派尔
(一)tRNA的叠加阿斯普（PDB ID:2TRA）和tRNA苯丙氨酸tRNA上的（PDB ID:1EHZ）结构派尔MmPylRS NTD•tRNA派尔复合物是通过叠加受体茎、反密码子茎和T–茎/环的磷原子（tRNA的40个原子天冬氨酸，rmsd=3.04，tRNA为41苯丙氨酸，rmsd=3.21）。MmPylRS NTD显示为曲面模型。(b条)tRNA可变环的特写天冬氨酸和tRNA派尔（分别为A44-U47和C45-G47）。(c（c）)tRNA可变环的特写苯丙氨酸和tRNA派尔（分别为A44-C48和C45-G47）。MmPylRS NTD和标准tRNA之间的空间位阻由黑色虚线圆圈表示。为了清楚起见，省略了转录后修改。(d日)三叶草结构马赛先生tRNA派尔,酿酒酵母tRNA天冬氨酸、和酿酒酵母tRNA苯丙氨酸显示变量循环的不同大小。
图3
图3。PANCE方法应用和概述
(一)PANCE方法首先培养寄主菌株大肠杆菌直到A600=0.3–0.5（大体积），然后在4°C下储存电池。然后将50 mL的等分试样转移到较小的烧瓶中，补充BocK和诱变质粒MP6的诱导剂阿拉伯糖（Ara），并用选择噬菌体（SP）转染。该培养物在37°C下孵育8-12小时，以促进噬菌体生长，噬菌体滴度的测定证实了这一点。噬菌体生长后，用一小份受感染细胞转染含有宿主的后续培养瓶大肠杆菌这一过程一直持续到所需的表型进化，以便根据需要进行多次转移。(b条)PANCE通过chPylRS改进了BocK的合并。三个含有chPylR的SP独立株系在宿主间连续传代大肠杆菌含菌株gIII型。中UAG密码子的数量gIII型在BocK在场的情况下，在连续传代期间稳步增长。在18-21次转移后，每个谱系都能在三个UAG密码子的作用下存活下来gIII型（P29am/E84am/Y183am），并在此环境中生长，以进行多次转移，从而使有利的突变在群体中固定。谱系命名为32A、24B和25C；数字表示传输次数。有关更多详细信息，请参阅联机方法.
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