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.2017年4月6日；8(35):58338-58352.
doi:10.18632/目标16873。 eCollection 2017年8月29日。

炎症因子TNF-α通过TNFR1/NF-κB（和/或p38）/p-STAT3/HBXIP/TNFR1的正反馈回路促进乳腺癌的生长

蔡晓丽 1, 曹灿（Can Cao） 1, Jiong Li（李炯） 2, 陈福泉 2, 张淑琴 2, 刘伯文（Bowen Liu） 1, 张伟英 1, 张晓东 2, 叶丽红 1
附属公司

炎症因子TNF-α通过TNFR1/NF-κB（和/或p38）/p-STAT3/HBXIP/TNFR1的正反馈回路促进乳腺癌的生长

蔡晓丽等。 Oncotarget公司. .

摘要

在炎症和癌症发展之间的联系中，肿瘤坏死因子α（TNF-α）有助于肿瘤的发生。然而，人们对其根本机制仍知之甚少。在本研究中，我们报道TNF-α通过上调癌蛋白乙型肝炎X相互作用蛋白（HBXIP）促进乳腺癌的生长。我们的数据表明，临床乳腺癌组织中TNF-α水平与HBXIP水平呈正相关。此外，TNF-α可以上调乳腺癌细胞中的HBXIP。有趣的是，TNF-α受体1（TNFR1）的沉默阻断了TNF-β对HBXIP的作用。从机制上讲，我们揭示了TNF-α可以通过激活转录因子信号转导子和转录激活子3（STAT3）来提高HBXIP启动子的活性。此外，核因子κB（NF-κB）和/或p38信号转导增加了细胞中p-STAT3的水平。值得注意的是，HBXIP还可以上调TNFR1，形成TNFR1/NF-κB（和/或p38）/p-STAT3/HBXIP/TNFR1的正反馈回路。值得注意的是，TNF-α能够通过驱动循环上调TNFR1。在功能上，我们证明HBXIP的敲除显著地抑制了TNF-α介导的乳腺癌的生长在体外和体内因此，我们得出结论，TNF-α通过TNFR1/NF-κB（和/或p38）/p-STAT3/HBXIP/TNFR1的正反馈回路促进乳腺癌的生长。我们的发现为TNF-。

关键词：HBXIP；STAT3；肿瘤坏死因子-α；乳腺癌；增长。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突没有要披露的利益冲突。

数字

图1
图1。注射TNF-α能够通过激活TNFR1促进乳腺癌细胞的增殖
（A、B）MTT法测定分别加入20 ng/ml TNF-α并瞬时转染si-TNFR1的MDA-MB-468和SK-BR3中TNF-对细胞增殖的影响。（C）在加入20 ng/ml TNF-α并瞬时转染si-TNFR1的MDA-MB-468细胞中，通过EdU分析测定TNF-对细胞增殖的影响。（D）通过单层集落形成实验检测TNF-α和si-TNFR1对MDA-MB-468和SK-BR3细胞克隆原性的影响。误差线代表±标准偏差*第页< 0.05, **第页<0.01，学生的t吨测试。所有实验重复至少3次。
图2
图2。临床乳腺癌组织中TNF-α与HBXIP呈正相关，乳腺癌细胞中HBXIP上调
（A）qRT-PCR检测临床乳腺癌组织中TNF-αmRNA的相对水平（n=24）(*第页<0.05，Wilcoxon的符号秩检验）。（B）通过qRT-PCR检测上述样本中HBXIP和TNF-α的相对mRNA水平，并根据GAPDH标准化（Spearman相关系数=0.7684**第页< 0.01).（C、D）分别用10 ng/ml、20 ng/ml TNF-α处理MDA-MB-468和SK-BR3细胞，通过qRT-PCR和Western blot分析检测HBXIP的mRNA和蛋白水平。（E）通过qRT-PCR和Western blot分析，在一个时间过程（0-48小时）中用20 ng/ml TNF-α处理MDA-MB-468细胞，测量HBXIP在mRNA和蛋白水平上的表达。（F）用qRT-PCR和Western blot检测经20 ng/ml TNF-α处理并转染siTNFR1的MDA-MB-468细胞中HBXIP和TNFR1表达水平。（G、H）进行双荧光素酶报告基因测定，以检测添加到5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml TNF-α和/或用100nM、200nM siTNFR1瞬时转染的MDA-MB-468细胞中HBXIP启动子的相对活性。误差线代表±标准偏差*第页<0.05时**第页<0.01，学生的t吨测试。所有实验至少进行了3次。
图3
图3。TNF-α通过激活转录因子STAT3激活HBXIP启动子
（A）图中显示了HBXIP启动子中对STAT3反应的野生或突变序列。（B）用荧光素酶报告基因检测法检测含野生型（wt）或突变型STAT3（STAT3-mut）结合位点的HBXIP启动子在给予10 ng/ml、20 ng/ml TNF-α的MDA-MB-468细胞中的相对活性。（C）通过荧光素酶报告基因检测，在给予20 ng/ml TNF-α并瞬时转染STAT3 siRNA的MDA-MB-468细胞中检测HBXIP启动子的相对活性。（D）通过使用抗肿瘤坏死因子-α处理的MDA-MB-468细胞中p-STAT3抗体，通过CHIP分析检测HBXIP启动子中转录因子STAT3的富集。（E）通过Western blot分析检测转染STAT3 siRNAs的MDA-MB-468细胞中STAT3、p-STAT3的水平。误差线代表±标准偏差*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，学生t吨测试。所有实验重复至少3次。
图4
图4。TNF-α通过NF-κB和/或p38信号在HBXIP启动子激活中增强STAT3磷酸化
（A）用20 ng/ml TNF-α处理MDA-MB-468细胞并瞬时转染siTNFR1（200nM），对其进行免疫荧光和核质p-STAT3表达分析。显示p-STAT3（绿色）的免疫荧光图像。DAPI染色（蓝色）显示细胞核。（B）采用Western blot检测20 ng/ml TNF-α和/或60μM PDTC处理MDA-MB-468细胞后p-STAT3和HBXIP的水平。（C）Western blot分析检测20 ng/ml TNF-α、10μM和20μM SB202190处理MDA-MB-468细胞后p-p38、p-STAT3和HBXIP的水平。（D）用20 ng/m TNF-α、60μm PDTC、20μm SB202190或PDTC与SB202190.联合处理MDA-MB-468细胞，进行HBXIP表达的免疫荧光分析。显示HBXIP的免疫荧光图像（红色）。DAPI染色（蓝色）显示细胞核。（E）采用双荧光素酶报告基因检测法检测20 ng/m TNF-α与60μm PDTC、20μm SB202190或PDTC与SB2021900联合作用后MDA-MB-468细胞中HBXIP启动子的相对活性。误差线代表±标准偏差*第页< 0.05, **第页<0.01，学生的t吨测试。所有实验至少进行了3次。
图5
图5。TNF-α升高的HBXIP上调乳腺癌细胞TNFR1的表达
（A）通过qRT-PCR分析检测临床乳腺癌组织中TNFR1的表达水平（n=24）(*第页<0.05，Wilcoxon的符号秩检验）。（B）通过qRT-PCR分析检测上述样本中HBXIP和TNFR1的相对mRNA水平（Spearman相关=0.5414*第页< 0.05).（C）在用pCMV HBXIP或siHBXIP瞬时转染的MDA-MB-468细胞中，通过qRT-PCR分析检测TNFR1和HBXIP mRNA水平的相对倍数变化。（D，E）通过Western blot分析检测转染pCMV-HBXIP或siHBXIP和/或用20 ng/ml TNF-α处理的MDA-MB-468细胞中TNFR1和HBXIP的表达水平。误差条表示±s.d。，*对< 0.05, **第页<0.01，学生的t吨测试。所有实验重复至少3次。
图6
图6。TNF-α通过HBXIP促进乳腺癌生长在体外
（A、B）在瞬时转染siHBXIP并用20 ng/ml TNF-α处理的MDA-MB-468细胞中，通过MTT和集落形成试验检测HBXIP敲除对TNF-β升高的细胞增殖的影响。（C）用流式细胞术分析MDA-MB-468细胞中HBXIP敲除和TNF-α对细胞周期的影响。（D）MTT法检测STAT3敲除和HBXIP对MDA-MB-468细胞中TNF-α增强细胞增殖的影响。（E）通过Western blot分析验证了HBXIP在MDA-MB-468细胞中的表达水平。误差线代表±标准偏差*第页< 0.05, **第页<0.01，学生的t吨测试。所有实验重复至少3次。
图7
图7。TNF-α通过HBXIP促进乳腺癌生长体内
（A）各组肿瘤显示在上面板中。裸鼠移植MDA-MB 468细胞后肿瘤生长曲线如下图所示（n=5）。（B）显示各组肿瘤重量。（C）免疫组化法检测小鼠肿瘤组织中Ki67和HBXIP的表达。（D）Western blot分析检测小鼠肿瘤组织中HBXIP和TNFR1的表达水平。误差线代表±标准偏差*第页<0.05，学生的t吨测试。所有实验至少进行了3次。
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