Label-free, direct localization and relative quantitation of the RNA nucleobase methylations m6A, m5C, m3U, and m5U by top-down mass spectrometry

doi:10.1093/nar/gkx470

.2017年7月27日；45(13):8014-8025.

doi:10.1093/nar/gkx470。

自顶向下质谱法对m6A、m5C、m3U和m5U RNA碱基甲基化的无标签直接定位和相对定量

海德琳德·格拉斯纳¹, 克里斯蒂安·瑞姆¹, 罗纳德·米库拉¹, 凯瑟琳·布鲁克¹

附属公司

PMID： 28549193
PMCID公司：项目编号：C5570050
内政部： 10.1093/nar/gkx470个

自顶向下质谱法对m6A、m5C、m3U和m5U RNA碱基甲基化的无标签直接定位和相对定量

海德琳德·格拉斯纳等。核酸研究. 2017.

.2017年7月27日；45(13):8014-8025.

doi:10.1093/nar/gkx470。

作者

海德琳德·格拉斯纳¹, 克里斯蒂安·瑞姆¹, 罗纳德·米库拉¹, 凯瑟琳·布鲁克¹

附属

¹因斯布鲁克大学有机化学研究所和分子生物科学中心（CMBI）。

PMID： 28549193
PMCID公司：项目编号：C5570050
内政部： 10.1093/nar/gkx470

摘要

核酸甲基化是核糖核酸（RNA）普遍存在的转录后修饰，可以以高度动态的方式大幅增加RNA的结构多样性，对基因表达和人类疾病具有潜在影响。然而，高通量、深度测序通常不能提供转录后修饰（PTM）的信息。自上而下的质谱（MS）是表征PTM的一种很有希望的替代方法，即其识别、定位和相对定量。在本研究中，我们研究了特定的碱基甲基化如何影响电喷雾离子化（ESI）中的RNA离子化，以及碰撞活化离子化和电子离子化中的骨架裂解。为此，我们开发了两种新的方法来表征RNA异构体或非异构体RNA形式混合物中的RNA甲基化。对解离实验中的碎片离子进行分析，以确定修饰类型，定位修饰位点，并揭示每个位点特定的修饰相对程度。

©作者2017。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**方案1。**
甲基化核苷残基的化学结构研究：N个⁶-甲基腺苷（m⁶A），5-甲基胞苷（m⁵C），3-甲基尿苷（m^三U）和5-甲基尿苷（m⁵U） ●●●●。

**方案3。**
(A类)RNA异构体和形式的示意图，m表示甲基化位点，以及(B类)20 nt（A）的计算同位素剖面₅C类₅G公司₅U型₅)，40吨（安₁₀C类₁₀G公司₁₀U型₁₀)和80 nt（A₂₀C类₂₀G公司₂₀U型₂₀)有（空心圆圈）和没有（实心圆圈）单一甲基化的RNA（+CH₂，14.0157 Da）。

**图1。**
23 nt RNA 1:1:1混合物ESI的质谱**4, 5**和6（每个0.5或1μM），1:1小时₂O/CH公司_三OH使用(A类)25 mM哌啶(B类)25 mM哌啶和25 mM咪唑(C类)20 mM信道_三库恩₄作为添加剂，插图显示了同位素剖面最丰富（M−n个H）^n个−离子和（D）（M−n个H）^n个−哌啶（填充圆圈）和哌啶/咪唑（开放圆圈）的离子数（顶部）和平均产率（底部）与净电荷的偏差。颜色编码是指m的数量⁶A残基：红色代表1（RNA4)，紫色代表2（RNA5)蓝色代表3（RNA6).

**图2。**
产量（M−n个H）^n个−来自27 nt RNA 1:1:1:1:1混合物的ESI离子**7, 8, 11, 12**和13（每1小时0.5μM₂O/CH公司_三OH与30mM哌啶和30mM咪唑作为添加剂）与电荷的关系，左插图显示了具有（M−6H）同位素谱的相应质谱区域⁶⁻离子，右插图显示产量与样品纯度呈线性相关。颜色编码是指m的数量⁵C残基：灰色表示0（RNA7)，红色表示1（RNA8)，紫色表示2（RNA11)，蓝色表示3（RNA12)，绿色表示4（RNA13).

**图3。**
产量（M−n个H）^n个−15 nt RNA 1:1:1混合物ESI中的离子**1, 2**和三1:1小时₂O/CH公司_三OH与总RNA浓度之比，添加20 mM哌啶（圆形）、20 mM吡啶和20 mM咪唑（钻石）或20 mM醋酸铵（三角形）。开放符号表示来自各个光谱的数据，填充符号显示平均值，标准偏差作为误差条。颜色编码是指m的数量⁵U残基：灰色表示0（RNA1)，紫色代表2（RNA2)绿色代表4（RNA三).

**图4。**
(A类)同分异构27 nt RNA 1:1:1混合物的自上而下MS（ESI、离子隔离和CAD）**8, 9**和10带有m⁵C分别位于位点10、20和21（1:1 H中各0.5μM₂O/CH公司_三OH与30 mM哌啶和30 mM咪唑）(B类)非甲基化（左）和单甲基化（右）MS信号***c（c）***₉,***c（c）***₁₀,***c（c）***₂₀和***c（c）***₂₁CAD中的碎片（M−6H）⁶⁻96 eV实验室框架能量下的离子(C类)甲基化部分***c（c）***（圆，左轴）和甲基化年96、102和108 eV时CAD的（三角形，右轴）碎片与解理位点。

**图5。**
甲基化部分***c（c）***（圆，左轴）和年（M−13H）CAD（175.5 eV实验室框架能量）的（三角形，右轴）碎片¹³⁻来自52 nt RNA形式的～1:1混合物的ESI离子14和15（1:1小时内各1μM₂O/CH公司_三OH与100 mM哌啶和100 mM咪唑）对比裂解位点；虚线表示m^三RNA第31位的U15.

**图6。**
(A类)未甲基化（左）、单甲基化（中）和双甲基化（右）年₈,年₉和年₁₀碎片（颜色编码如图2所示）和(B类)甲基化部分***c（c）***（顶部）和年（M−4H）CAD（48、50、52或54 eV实验室框架能量）的碎片（底部）⁴⁻15 nt RNA形式1:1混合物的ESI离子1和2（根据10次测量，每种RNA形式在1:1 H中的0.25、0.5或1μM₂O/CH公司_三OH与20 mM哌啶和20 mM咪唑或20 mM醋酸铵）对裂解位点；虚线表示m⁵RNA第6和第7位点的U2.

**方案4。**
甲基化的理论分数***c（c）***（圆圈）和年假设1:1:1 RNA混合物CAD的（三角形）片段(A类)具有两个甲基化和(B类)具有0、1和2甲基化的形式；每个片段的甲基化数目用彩色编码条表示（红色表示1，紫色表示2甲基化）。

**图7。**
的分数(A类)***c（c）***和B）年（M−5H）的CAD碎片（在75、77.5和80 eV实验室框架能量下三次测量的平均值，对相对碎片丰度没有显著影响）⁵⁻来自23 nt RNA形式1:1:1混合物的ESI离子**4, 5**和6（1:1小时内各1μM₂O/CH公司_三OH与20 mM CH_三库恩₄作为添加剂，图1C）⁶A残基分别与裂解位点；颜色编码表示片段的甲基化数量：灰色=0，红色=1，紫色=2，蓝色=3。

**图8。**
的分数(A类)***c（c）***和(B类)年CAD中的碎片（M−6H）⁶⁻五种27 nt RNA 1:1:1:1:1混合物的离子**7, 8, 11, 12**和130、1、2、3和4米⁵C残留物分别从2.5μM（总RNA浓度）溶液中以1:1的时间进行电喷涂₂O/CH公司_三OH，添加30 mM哌啶和30 mM咪唑；颜色编码表示片段的甲基化数量：灰色=0，红色=1，紫色=2，蓝色=3，绿色=4。

**图9。**
的分数(A类)d日和(B类)w个（M−12H）EDD（26 eV电子能量）碎片¹²⁻来自ESI的离子（在1:1 H中各0.5μM₂O/CH公司_三OH，25 mM哌啶作为添加剂，图1A），23 nt RNA形式的1:1:1混合物**4, 5**和61米、2米和3米⁶A残基，分别相对于切割位点；颜色编码表示片段的甲基化数量：灰色=0，红色=1，紫色=2，蓝色=3。

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1. 王霞，何春红。转录后调控中的动态RNA修饰。分子细胞。2014; 56:5–12.-项目管理委员会-公共医学

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