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.2017年3月9日；543(7644):261-264.
doi:10.1038/nature21382。 Epub 2017年3月1日。

体细胞层粘连蛋白的分子结构

雅格穆尔·图尔盖 1, 马提亚斯·艾鲍尔 1, 安妮·E·戈德曼 2, 武士世美 2, 马扬·卡亚特 三, 科菲尔·本·哈鲁什 4, 安娜·杜布罗夫斯基-高普 1, K塔努吉·萨普拉 1, 罗伯特·D·戈德曼 2, Ohad Medalia公司 1 三
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体细胞层粘连蛋白的分子结构

雅格穆尔·图尔盖等。 自然. .

摘要

核纹层是后生动物细胞核的基本组成部分。它主要由层粘连蛋白组成，层粘连是中间丝蛋白，组装成丝状网，桥接核膜和染色质。除了为细胞核提供结构稳定性外，叶片还参与许多核活动，包括染色质组织、转录和复制。然而，核膜的结构组织尚不清楚。在这里，我们使用低温电子断层扫描获得椎板内椎板网组织的详细视图。对单个层粘连丝的数据分析可解析出一种球状降解纤维外观，并表明a型和B型层粘连组装成3.5 nm厚的四聚体纤维。因此，层粘连蛋白呈现出一种与其他典型细胞骨架元素显著不同的结构。我们的发现以分子分辨率定义了核层压板网络的结构，为其在构建核层压板中的作用提供了见解。

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扩展数据图1
扩展数据图1。Cryo-ET和3D-SIM中波形蛋白缺陷MEF的样品制备
（a） 免疫标记wt和Vim的3D-SIM图像−/−MEF显示了层粘连蛋白A和层粘连素B1的类似定位和表达。比例尺，5μm。（b） 对所示MEF细胞系进行的Western blot分析显示，在shRNAi介导的波形蛋白敲除后，每个层粘连蛋白亚型的表达水平和层粘连的保留不变。（c） 预渗透、核酸酶处理和免疫标记MEF的3D-SIM图像显示，与未处理细胞相比，层粘连蛋白A和层粘连膜B1的定位和表达相似（A）。比例尺，1μm。（d） 如3D-SIM分析所示，叶片相关蛋白（LAP）、emerin和Lap2β的定位在预渗透和核酸酶处理的（+）细胞和未处理的（-）细胞之间表现出高度相似性。比例尺，1μm。（e） 低温-ET样品制备程序说明。
扩展数据图2
扩展数据图2。Cryo-ET电磁栅上的玻璃化MEF核外壳
（a） 100×100μm上两个核（被红线包围）的低倍视图2电子网格比例尺的碳网，50μm。（b） 图中显示了细胞核的一部分（由浅灰色线条勾勒）。1.4×1.4μm的低温层析图2在所示区域内的不同位置获得（1-4）。图1b所示为区域1-4内包含细丝的子体积中的代表性xy片。比例尺，2μm。（c） 细胞核的高倍投影图显示了细胞核的一些典型组成部分，例如保存的核双膜区域（白色箭头）、NPC（白色箭头）和具有假定染色质残余的高密度区域（在左上角）。比例尺，1μm。（d） 连续的1.36 nm xy切片显示了层粘连网的厚度，并偶尔显示出可能观察到的染色质残余物（白色箭头）。比例尺，100 nm。（e） 渲染显示分节的层粘连丝（黄色）和假定的染色质残留物（蓝色）。这张分割的核膜图显示了在约14 nm的边界内沿z轴在不同位置相互交叉的单个细丝。比例尺，100纳米。
扩展数据图3
扩展数据图3。A型和B型层粘连蛋白的免疫金标记
用α-层粘连蛋白A/C或α-层黏连蛋白B1抗体处理EM-grids上的细胞核，并在玻璃化和冷冻-ET分析之前用6nm金结合蛋白A标记。对照样品仅用蛋白A结合物处理。（a） 原子核的投影视图（由浅灰色线轮廓）显示了金共轭物的分布。比例尺，200 nm。（b） 放大后的图像显示，9纳米厚的xy片通过各自的免疫金标细胞核的重建体积。A型和B型细丝用金缀合物标记，如图所示（红色圆圈）。比例尺，100 nm。（c） 40 nm厚亚体积的免疫金标、分段和骨架化细丝的画廊视图。绿色圆点表示免疫金标记的层粘连蛋白A和红色圆点层粘连肽B1，各有九个亚体积，位于稀疏和密集的区域内。比例尺，200 nm。（d） 方框图显示每μm层粘连蛋白A/C和层粘连膜B1的免疫金标密度2（+/−SD）（白线表示中位数，黑点表示黄金颗粒的平均数量）。
扩展数据图4
扩展数据图4。A型和B型层粘连蛋白的联合免疫标记
（a） 在玻璃化和冷冻-ET分析之前，用α-层粘连蛋白a/C和α-层黏连蛋白B1处理EM-grids上的细胞核，并分别用6 nm和10 nm金共轭物标记。对照样品（中部和右侧）在用6 nm金共轭物处理之前用α-层粘连蛋白A/C处理，固定后用10 nm金共轭体处理（中间面板），或者只用6 nm和10 nm金结合物处理（右侧面板），省略与抗体的孵育。部分核的大投影视图（由浅灰色线轮廓）显示了在指定条件下金共轭物的分布。比例尺，200 nm。（b） 方框图显示了每μm 6 nm（层粘连蛋白A/C）和10 nm（层粘蛋白B1）金颗粒的标记密度2（+/-SD）（白线表示中位数，黑点表示金颗粒的平均量）。从47个子卷（左面板）、9个子卷（中面板）或11个子卷（右面板）中提取黄金颗粒数量。（c） 为了验证大小胶体金的可靠分配，从含有6 nm或10 nm胶体金（单个胶体金）的样品中手动选取6 nm和10 nm胶体黄金结合蛋白A标签，这两种胶体金的混合物（混合胶体金）或联合免疫金标记实验（层粘连蛋白A/C和B1联合标记实验）和平均值（n=200每种情况）。底部的两幅图像显示了9个单独的6nm（左）和10nm（右）金结合蛋白a标签的拼贴，它们分别来自联合免疫金标记实验。线形图显示了从所示样品中提取的金结合蛋白A标签平均直径的归一化强度分布。实线显示了仅含有一种胶体的样品的平均金标签的强度分布。虚线显示了从混合物中提取的平均金色标签的强度分布。带钻石的线条显示了联合免疫金标记实验中平均金标记的轮廓。6nm和10nm平均金缀合的蛋白A标记物的线轮廓分别以绿色和红色显示。线形图显示了每个条件下6纳米或10纳米金标签的几乎相同直径。
扩展数据图5
扩展数据图5。拉明纤维分类和平均
（a） 画廊视图显示了一组提取并对齐的细丝，用于进一步分析。（b） 在40个人口最多的平均阶级中，有36个阶级的蒙太奇展示了棒状结构，其两侧是球状畴，位于中央棒的不同位置。黄色圆点表示图3a、b和c中所示的四个人口最多的类。类索引在子帧的左上角给出，左下角给出了相应类中的粒子数。（c） 类别平均数与指数2和5（图3c）的比较体外数据显示出显著的相似性（黄色箭头）。
扩展数据图6
扩展数据图6。结构分析体外组装的A型和B型层粘连蛋白副晶体
中的最后一步体外组装好的A型和B型层粘连蛋白的组装导致了具有相同组织结构的副晶体的形成，证实了A型和B-型层粘着蛋白组装成类似结构（A）TEM分析和负染人类层粘连C的比较2、B1和B2副晶体显示相同的条纹图案，重复20 nm。比例尺，20 nm。（b） Cryo-ET分析体外与（A）中所示的层粘连蛋白亚型相比，组装的层粘着蛋白A显示相同的20 nm重复模式。比例尺，20 nm。（c） 该模型显示了层粘连原丝在共生晶体中的二维排列。杆状结构以灰色显示，球状尾部区域以红色显示。（d）体外如（b）所示，组装好的层粘连蛋白A显示了包含20 nm距离的所谓免疫球蛋白结构域的条纹图案，与我们的一些结构类中重复的球状结构域对的间距相当就地结构分析（图3a和b）。副晶体条纹内假定的免疫球蛋白折叠区的距离为6 nm。比例尺，20 nm。
扩展数据图7
扩展数据图7。拉明装配方案
所检查的层粘连丝的平均值和分类就地表明层粘连丝由两个半交错的头尾聚合物组成。为此，层粘连二聚体（左）组装成具有短重叠区域、四聚体横截面（中）的二聚体头尾聚合物。沿头尾聚合物的免疫球蛋白（红色）每隔约40 nm定位一次。最终，两个头尾聚合物横向组装成一个具有均匀形状的杆（直径约3.5 nm）的原丝（右），其中包含交替的四聚体和六聚体区域。在这种组装状态下，Ig结构域沿着原丝每隔20nm定位一次。
图1
图1。哺乳动物细胞核膜丝状网的结构
（a） 70 nm厚层析切片的渲染图显示了细胞核顶部推测的层粘连丝（黄色）、NPC（红色）和偶尔观察到的细胞质肌动蛋白丝（绿色）。比例尺，200 nm。（b） 核膜不同区域的2 nm厚层析切片（如扩展数据图2b所示）。比例尺，100纳米。（c） 灯丝长度分布直方图。（d） 持久性长度分布直方图（e）含层厚度直方图。
图2
图2。层压板网络的特征
（a） 从9个不同核的不同位置的25个亚体积渲染层粘连丝。比例尺，200 nm。（b） 层粘连丝平均占有率直方图。（c） 免疫金标记的细胞核的9nm厚断层图像切片的渲染图显示了层粘连丝（黄色）、NPC（红色）和金缀合物（黑色）。比例尺，100 nm。（d） 共免疫金标记细胞核的14nm厚层析切片显示，分别用6nm（绿色圆圈）和10nm（红色圆圈）金结合物标记的A型和B型细丝。比例尺，100 nm。（e） 来自36个层析亚体积的共免疫标记A型和B型层粘连蛋白与绿色层粘连A/C和红色层粘连B1结合。标记被描绘为圆形高斯函数，其半高宽分别为10 nm（e，左）和120 nm（e（右）。比例尺为1μm。（f） 层粘连蛋白A和B1的共同免疫荧光，由3D-SIM以约110–130 nm的分辨率显示。比例尺，1μm。
图3
图3。层粘连丝的结构分析
（a，b）一些灯丝类别显示沿杆（虚线）成对球状畴之间约20 nm的交替距离。（c） 球状区域（红色箭头）出现在杆的每一侧（蓝色箭头）或杆的同一侧。比例尺，5 nm。（d） 归一化强度剖面中的虚线和连续线分别表示杆（蓝色箭头）和球状区域（红色箭头）的平均直径，如（c）所示。杆左侧和右侧球状畴之间的距离约为12 nm。（e） 层粘连丝模型说明了棒状畴的均匀厚度和球状畴（红色）在棒状区旁边的位置。（f） 根据对所示线圈结构的分析，线圈二聚体、四聚体和六聚体的横截面说明了二聚体的非各向同性厚度,.
图4
图4。哺乳动物体细胞的核膜和细胞骨架成分
（a） 将层粘连蛋白（深灰色的杆状结构域和红色的Ig结构域）、NPC（蓝色）以及INM和ONM（透明灰色）建模到包含层粘连网的冷冻断层图像的区域中（见图第1a段）。（b） 在4nm厚的层析切片中，细胞骨架元素之间的比较显示了MTs、肌动蛋白、波形蛋白和层压板的直径。比例尺，20 nm。
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