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.2017年2月10日；8(1):34.
doi:10.1186/s13287-017-0480-y。

Let-7a转染的间充质干细胞通过STAT3-BMPR2信号抑制肺动脉平滑肌细胞生长改善野百合碱诱导的肺动脉高压

Gesheng Cheng先生 1, 王兴业 2, 李永新 三, 陆河 1
附属公司

Let-7a转染的间充质干细胞通过STAT3-BMPR2信号抑制肺动脉平滑肌细胞生长改善野百合碱诱导的肺动脉高压

Gesheng Cheng先生等。 干细胞研究与治疗. .

摘要

背景：基于细胞的基因治疗已成为治疗肺动脉高压（PAH）的一个热门课题，肺动脉高压是一种以肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增生为特征的毁灭性疾病。间充质干细胞（MSCs）最近被公认为一种潜在的基因治疗细胞载体。在此，我们研究了基于MSC的let-7a对PAH的影响。

方法：从大鼠骨髓中分离和鉴定MSCs后，用重组腺病毒载体Ad-let-7a感染细胞。Lewis大鼠皮下注射野百合碱（MCT）诱导PAH，然后分别注射MSCs、MSCs-NC（miR-control）或MSC-let-7a。然后，评估右心室收缩压（RVSP）、右心室肥厚和肺血管重塑。缺氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞（rPASMCs）与MSCs或MSC-let-7a共培养。细胞增殖和凋亡分别由三H胸苷掺入和流式细胞术分析。还研究了其潜在机制。

结果：MSC移植提高了MCT诱导的PAH大鼠的let-7a水平。注射MSC-let-7a后，RVSP、右心室肥厚和肺血管重构显著改善，表明MSC-let-1a对PAH具有保护作用。与MSC-let-7a共培养时，低氧刺激的PASMC增殖明显减弱，同时细胞增殖相关蛋白减少。同时，MSC-let-7a给药显著消除了PASMCs对凋亡的抵抗。机制分析表明，MSC-let-7a抑制信号转导子和转录激活子3（STAT3）的激活，并增加其下游骨形态发生蛋白受体2（BMPR2）的表达。重要的是，BMPR2 siRNA预处理显著减轻了MSC-let-7a对PASMC增殖和凋亡抵抗的抑制作用。

结论：总之，这项研究表明，用let-7a修饰的MSCs可以通过STAT3-BMPR2信号抑制PASMC的生长，从而改善PAH的进展，这为PAH患者提供了一种有前景的治疗策略。

关键词：BMPR2；肺动脉高压；STAT3通路；let-7a；间充质干细胞；肺动脉平滑肌细胞。

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数字

图1
图1
MSC的特征。一第3代MSCs的形态学特征。b条流式细胞术分析表明骨髓间充质干细胞的主要表型特征（CD34−，Cd45−，CD44+和CD90+).c（c）为了评估MSCs的成骨能力，用2%茜素红S染色细胞。在MSCs中观察到茜素红S-阳性矿物沉积。d日细胞用0.3%油红O染色以评估其成脂能力。显微镜分析证实了MSCs中脂质的积聚。放大倍数×200
图2
图2
let-7a在MSCs和PAH大鼠中的表达。大鼠注射MCT（60 mg/kg）2周，诱导PAH模型。然后，将PBS和MSCs注射到PAH大鼠体内。用定量RT-PCR分析let-7a的表达(一). MSCs暴露于低氧（3%氧气）或常氧（对照组）24 h。在对照组和缺氧处理组中检测let-7a的表达(b条). 为了探讨MSC治疗PAH的效果，MSC暴露于Ad-let-7a或Ad-NC病毒并培养48 h。然后，进行定量RT-PCR检测MSCs中let-7a的表达(c（c）). *第页 < 0.05
图3
图3
MSC-let-7a对PAH发展的影响。大鼠在腹腔注射MCT 2周后给予PBS、MSCs、MSC-NC或MSC-let-7a。在注射后7、14和21天采集血样。用定量RT-PCR分析let-7a的表达(一)大约3周后，对let-7a在肺组织中的表达进行了分析(b条). 通过右颈静脉将3-F Miller导管插入右心室，分析MSC-let-7a对RVSP的影响(c（c）). 然后，对大鼠实施安乐死，并采集心脏和肺组织。RV/LV+S的比率(d日)和RV/BW(e（电子）)测定右心室肥厚。用RIPA缓冲液溶解后，用定量RT-PCR检测肺组织中Fn的mRNA水平(（f）). 用Western blotting分析α-SMA的表达(克). 肺组织用石蜡包埋，然后切割成4μm厚的连续切片。然后通过HE染色评估壁厚(小时). *第页 < 0.05.BW公司体重，低压左心室，MCT公司野百合碱，移动交换中心间充质干细胞，数控miR-控制，美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水，RV汽车右心室，RVSP（RVSP）右心室收缩压，S公司隔膜，座椅模块组件平滑肌肌动蛋白
图4
图4
MSC-let-7a给药显著抑制PASMC增殖并降低其对凋亡的抵抗力。rPASMC暴露于低氧或常氧下24小时，然后使用跨阱系统与改良MSCs（MSC-NC或MSC-let-7a）共培养。培养约24小时后，收集PASMC。通过以下方法分析细胞活力三H-TdR型(一). 用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，然后进行SDS-PAGE。然后对样本进行蛋白质印迹分析。使用Gel-DocTM XR成像系统监测Ki67、cyclin D1、p21和PCNA的蛋白水平(b条). Image J软件也进行了相应的定量分析(c（c）). 对于细胞凋亡检测，引入约10μl Annexin V-FITC和5μl PI。流式细胞术检测细胞凋亡(d、 e（电子）). caspase-3活性也用商业试剂盒测定以评估细胞凋亡(（f）). *第页 < 0.05.移动交换中心间充质干细胞，数控miR-控制，PCNA公司增殖细胞核抗原
图5
图5
STAT3-BMPR2信号通路负责MSC-let-7a调节PASMCs的生长抑制。与let-7a或NC修饰的MSCs共培养后，通过Western blotting检测缺氧后PASMCs中STAT3、p-STAT3和下游BMPR2的表达水平。正常氧下培养的细胞被定义为对照组(一). 在用STAT3抑制剂S31-201（15μM）治疗后，分析PASMC中BMPR2的蛋白水平(b条). 用BMPR2 siRNA预处理24小时后，通过Western blotting测定BMPR2的蛋白水平(c（c）). 用BMPR2 siRNA处理PASMCs，并与MSC-let-7a或不与MSC-let-7a共同培养。细胞增殖(d日)和增殖相关基因表达（包括Ki67、细胞周期蛋白D1和PCNA）(e（电子）)然后确定。(（f）)流式细胞术检测细胞凋亡*第页 < 0.05.骨形态发生蛋白2骨形态发生蛋白受体2，移动交换中心间充质干细胞，数控miR-控制，PCNA公司增殖细胞核抗原，小干扰RNA小干扰RNA，定子3转录信号转导子和激活子3
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