High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells

doi:10.1016/j.molcel.2016.09.034

.2016年10月20日；64(2):416-430.

doi:10.1016/j.molcel.2016.09.034。

胚胎干细胞核蛋白组RNA-结合区的高分辨率定位

何崇升¹, 西蒙·西多利², 罗伯特·沃恩福德-汤姆森^三, 迪尔德雷·塔托默⁴, 杰里米·威鲁斯⁴, 本杰明·加西亚², 罗伯托·博纳西奥⁵

附属公司

¹美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞与发育生物学系，宾夕法尼亚州费城，19104，美国。
²美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。
^三美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编19104；宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理研究生组，宾夕法尼亚州费城，19104，美国。
⁴美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。
⁵美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞与发育生物学系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。电子地址：rbon@mail.med.upenn.edu。

PMID： 27768875
PMCID公司： PMC5222606型
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2016.09.034

胚胎干细胞核蛋白组RNA-结合区的高分辨率定位

何崇胜等。分子电池. 2016.

.2016年10月20日；64(2):416-430.

doi:10.1016/j.molcel.2016.09.034。

作者

何崇升¹, 西蒙·西多利², 罗伯特·沃恩福德-汤姆森^三, 迪尔德丽·塔托姆⁴, 杰里米·威鲁斯⁴, 本杰明·加西亚², 罗伯托·博纳西奥⁵

附属公司

¹美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞与发育生物学系，宾夕法尼亚州费城，19104，美国。
²美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。
^三美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理学研究生组，美国宾夕法尼亚州费城，邮编19104。
⁴美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院生物化学和生物物理系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。
⁵美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院表观遗传学项目，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104；美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞与发育生物学系，宾夕法尼亚州费城，邮编：19104。电子地址：rbon@mail.med.upenn.edu。

PMID： 27768875
PMCID公司： PMC5222606型
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2016.09.034

摘要

非编码RNA和染色质蛋白之间的相互作用在基因调控中起着重要作用，但大多数相互作用的分子细节尚不清楚。通过对胚胎干细胞细胞核进行蛋白质-RNA光交联和质谱分析，我们在肽分辨率下鉴定并绘制了约800个已知和以前未知的RNA结合蛋白中的RNA结合区域，其中许多是转录调节剂和染色质修饰剂。除了已知的RNA结合基序外，我们还检测到了几个以前未知的在RNA识别中起作用的蛋白质结构域，以及未注释和/或无序的区域，这表明许多功能性蛋白质与RNA的接触仍未被探索。我们在包括TET2在内的几个染色质调节器中鉴定了RNA结合区域，并验证了它们结合RNA的能力。因此，RNA-结合区域的蛋白质组学鉴定（RBR-ID）是绘制蛋白质-RNA相互作用的有力工具，将允许合理设计突变体，以在机械水平上剖析其功能。

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数字

**图1。RBR-ID的开发与优化**
（A）用4SU或未经处理（1和2）对小鼠ESC进行脉冲处理，并用不同的紫外线波长照射（3）。我们分离细胞核（4）并用蛋白酶和核糖核酸酶消化交联提取物，产生交联肽和非交联肽的混合物（5）。与RNA共价交联改变了肽质量，相应非交联肽的质谱强度降低（6；红色峰）。（B）示例未经处理（左）和4SU处理的ESC（右）的可比保留时间窗口的平均光谱。紫外线（312 nm）交联导致4SU样品中高亮光谱的强度降低。（C）定量（B）中突出显示的对照肽和HNRNPC肽的提取色谱图。条形图表示六次重复+SEM中未处理样品（无4SU）标准化峰值强度的平均值。（D）火山图显示了±UV（254 nm）和±4SU（312和365 nm）在x轴上肽强度和在y轴上p值的对数倍变化。与注释的RRM域重叠的肽显示为蓝色。来自HNRNPC的RNA-结合肽以红色突出显示。（E）具有持续（p<0.05）缺失肽的蛋白质数量，并在GO数据库中标注为RBP（黑色）或非RBP（灰色）。（F）根据所示研究和数据库，已知RBP的百分比，这些研究和数据库使用不同的UV波长进行交联。另请参见图S1。

**图2。RBR-ID鉴定蛋白质的蛋白质水平分析**
（A）散点图显示了生物复制品1-3和额外复制品4和5中肽的对数转换和归一化平均强度。（B）主要RBR-ID蛋白点击的前十个富集GO术语（生物过程和分子功能）。p值绘制在x轴上，错误发现率（FDR）<10%的术语显示为红色。（C）RBR-ID蛋白点击和所有已知RBP的重叠，都是实验确定的和数据库中注释的。p值来自超几何分布。（D）前十个富集GO术语，如（B）所示，但仅适用于RBR-ID蛋白质点击，在已知RBP集合中未找到。（E和F）前十个非冗余蛋白质结构域富集于主要RBR-ID蛋白质点击（E）或仅在未知RBP集合（F）中。堆叠条形图的黑色部分表示包含该结构域并在主要RBR-ID候选列表中找到的蛋白质数量；灰色部分表示不在RBR-ID列表中但通过MS在ESC核提取物中检测到的蛋白质的数量。（G） Tukey箱线图，用于比较（C）中已知RBP和未知推测RBP的每个蛋白质的最大RBR-ID分数分布。另请参见表S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7以及图S2。

**图3。利用RBR-ID体外定位MS2-CP的RBR**
（A）允许重组MS2外壳蛋白和含有或不含有4SU的体外转录干环RNA形成复合物，然后进行交联、消化和质谱分析。（B）带有或不带有4SU的MS2-SL RNA的下拉，并与具有不同UV波长的MS2-CP交联。通过其融合标签GST检测到MS2-CP。（C）提取的离子色谱图显示了RBR重叠肽（红色）和来自MS2-CP区域的不结合来自MS2-CP的RNA的肽（黑色）的洗脱谱，所述MS2-CP使用312nm UV交联到天然（顶部）或含4SU（底部）的MS2-SL RNA。（D）（C）中所示的两个肽的峰值强度的量化，用于三个生物复制品，每个复制品都是重复获得的。条形图显示平均强度+扫描电镜（SEM）。（E）沿着MS2-CP的一级序列绘制的平均和平滑的残余水平RBR-ID分数。没有肽覆盖的区域显示为空白。数据来自三个生物复制品，每个复制品都是重复的。图中显示了已知RBR和尿苷相互作用的glu 63残基的位置。另请参见表S8和图S3。

**图4。RBR-ID绘制体内蛋白质-RNA相互作用的位点**
（A） MS2外壳蛋白与其同源RNA复合物的表面呈现（PDB:1ZDI；Valegárd et al.，1997）根据图3所示实验的残留水平RBR-ID评分进行颜色编码。（B） U1 snRNP粒子的示意图（Kondo等人，2015；Pomeranz Krummel等人，2009）。RBR-ID候选主列表中的子单元为深红色；扩展列表中的蛋白质呈浅红色。（C和D）放大U1 snRNP晶体结构的区域（PDB:4PJO；Kondo等人，2015），显示根据其RBR-ID评分和U1-70K（C）和SmD2（D）两个区域的相互作用RNA进行颜色编码的蛋白质表面。（E和F）根据Wild和Cramer（2012），哺乳动物RNA pol II（E）和RNA pol I（F）复合物的示意图。颜色编码与（B）中相同。在核蛋白质组中检测到的亚单位（但未通过RBR-ID识别）为灰色，而检测不到的亚基为白色。酵母RNA pol I亚单位A14（虚线圈）的哺乳动物同源物未知。另请参见图S4。

**图5。ESC蛋白质组中已知和未知的RNA-结合区域**
（A）所有检测到的肽根据其RBR-ID评分（UV312±4SU）或对照评分（无UV±4SU）进行分类。在这些排名列表中，与RRM结构域（左）或对照非RNA结合结构域（IPR027417，右）重叠的肽的频率如图所示。（B）检测到的所有肽（左）或RBR-ID中主要列表中的肽（右）的解释注释类别。（C–E）与检测到的肽的完整列表相比，顶级RBR-ID肽中选定域的富集。图中显示了经典（C）和非经典（D）RNA-结合结构域以及之前未报道的结合RNA（E）的富集结构域。（F）所示肽组的等电点的Tukey箱线图。p值来自学生t检验。Tot，核蛋白质组中检测到的所有肽；uRBR，主要候选名单中与已知RBD不重叠的肽；RRM，所有检测到的肽与RRM结构域重叠。（G） IUPred中与无序区域重叠的肽的百分比（Dosztányi等人，2005；Oates等人，2013）。显示了所有检测到的肽（tot）、所有未映射到已知RNA结合域（uRBR）的顶级RBR-ID肽以及所有重叠RRM域的肽的值。p值来自chi-square测试。另请参见图S5。

**图6。L1TD1和TET2中RBR的验证**
（A） L1TD1的一级序列和已知域（顶部）；沿着一级序列（中间）绘制的平滑残差RBR-ID评分；以及用于验证的表位标记WT和RBR-删除（ΔRBR）结构的方案（底部）。（B） HEK293细胞中瞬时表达WT和ΔRBR L1TD1的PAR-CLIP。放射自显影术³²P标记RNA（顶部）和对照蛋白印迹（底部）。（C） WT L1TD1的PAR-CLIP，有无RNase A处理（顶部）和对照蛋白印迹（底部）。（D） TET2的一级序列和已知结构域（顶部）；沿着一级序列（中间）绘制的平滑残差RBR-ID评分；表位标记催化域片段（CD）和RBR缺失（CD）的方案_ΔRBR)用于验证的构造（底部）。（E）瞬时表达的TET2-CD和TET2-CD的PAR-CLIP_ΔRBR在HEK293细胞中。放射自显影术³²P标记RNA（顶部）和对照蛋白印迹（底部）。（F） TET2 CD的PAR-CLIP有无RNase A治疗（顶部）和对照蛋白印迹（底部）。另请参见表S8和图S6。

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中的注释

从蛋白质-RNA预测到肽-RNA编码。
Brannan KW，Yeo GW。 Brannan KW等人。分子细胞。2016年11月3日；64(3):437-438. doi:10.1016/j.molcel.2016.10.023。分子细胞。2016 PMID：27814488

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