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。2016年10月28日；291(44):22977-22987.
doi:10.1074/jbc。M116.744615。 Epub 2016年9月7日。

HIV-1 gp120糖蛋白与树突状细胞特异性细胞间粘附分子3-抓取非整合素（DC-SIGN）相互作用下调紧密连接蛋白破坏血视网膜屏障并增加其通透性

易文倩 1, 李川 1, 蒋爱萍 2, 圣方阁 1, 平谷 1, 仙群范 1, 李泰胜 三, 夏进 2 4, 王建华 5, 王志良 6
附属机构

HIV-1 gp120糖蛋白与树突状细胞特异性细胞间粘附分子3-抓取非整合素（DC-SIGN）相互作用下调紧密连接蛋白破坏血视网膜屏障并增加其通透性

易文倩等。 生物化学杂志。 。

摘要

大约70%的HIV-1感染者在发病过程中会发生眼部机会性感染并表现出眼部疾病。然而，病原体侵入眼部的机制尚不清楚。正常情况下，血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）具有发育良好的紧密连接复合体，形成血-视网膜屏障（BRB）以防止病原体入侵。我们假设BRB的破坏允许病原体进入眼部部位。该假设通过体外模型进行了验证。我们发现人类RPE细胞可以与HIV-1 gp120糖蛋白或HIV-1病毒颗粒结合。此外，这种结合由RPE细胞上表达的树突状细胞特异性细胞间黏附分子3-抓取非整合素（DC-SIGN）介导。gp120与DC-SIGN结合后，细胞NF-κB信号被触发，导致基质金属蛋白酶的诱导，随后降解紧密连接蛋白并破坏BRB完整性。DC-SIGN敲除或预先用特定抗体阻断可消除gp120诱导的基质金属蛋白酶表达，并减少紧密连接蛋白的降解。这项研究阐明了HIV 1型侵袭眼部组织的新机制，并为眼部并发症相关病原体的移位或侵袭过程提供了额外的见解。

关键词：DC-SIGN；HIV；HIV-1；血-肠屏障；糖蛋白；基质金属蛋白酶；视网膜；紧密连接；紧密连接蛋白。

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数字

图1。
图1。
ARPE-19细胞捕获HIV-1颗粒。 A类ARPE-19细胞上DC-SIGN和HIV-1受体的表达。用特异性抗体对细胞进行免疫染色，并用流式细胞仪进行分析。显示阳性细胞的百分比。B类和C类，HIV-1 VLP与ARPE-19细胞结合。用HIV-Gag-GFP-VLP/JRFL或VLP/ΔEnv在4°C下对细胞进行脉冲处理1 h，并使用流式细胞仪进行分析。总结了三个独立重复的结果(C类).天，重组gp120与ARPE-19细胞的结合。用重组gp120糖蛋白在4°C下对细胞进行脉冲处理1 h，然后用小鼠抗gp120抗体进行免疫染色，然后用二级抗鼠IgG-FITC进行免疫染色。用流式细胞仪分析细胞，并显示阳性细胞的百分比和MFI。E类，HIV-1 VLP的ARPE-19细胞捕获。ARPE-19细胞在37°C下与HIV-Gag-GFP-VLP/JRFL孵育1h，用胰蛋白酶处理5min或不处理，并使用流式细胞仪进行分析。间隙-GFP+给出了电池百分比和MFI。显示了四次重复的一个代表性结果。**，第页< 0.01; *,第页< 0.05.Iso标准，同型。
图2。
图2。
DC-SIGN介导HIV-1与ARPE-19细胞的结合。 A类和B类，用抗DC-SIGN抗体预先阻断可减少HIV-1 VLP结合。在4°C下进行VLP加载之前，用抗DC-SIGN抗体处理ARPE-19细胞。总结了四个独立重复的结果(B类). *,第页< 0.05.C-E公司，DC-SIGN基因敲除消除了HIV-1 gp120结合。有或无ARPE-19小区DC-SIGN公司在4°C下用HIV-1 gp120糖蛋白脉冲敲除，并如上所述检测gp120结合。显示了三次重复的一个代表性结果。数据为平均值±S.D(天).如果DC-SIGN基因敲除降低VLP/JRFL或VLP/HXB2的结合。有或无ARPE-19小区DC-SIGN公司用VLP/JRFL或VLP/HXB2在4°C下脉冲敲除1 h，并用流式细胞仪检测VLP结合。M.W.公司。，分子量；Iso标准，同型。
图3。
图3。
与ARPE-19细胞结合的Gp120下调紧密连接蛋白。 A类，Gp120诱导紧密连接蛋白的下调。用重组gp120糖蛋白处理ARPE-19细胞48小时，然后用针对ZO1、Claudin-5、Occludin或JAM-2的特异性抗体进行免疫染色，然后用抗兔或抗鼠IgG-FITC二级抗体进行免疫标记。用流式细胞术分析细胞。给出了阳性细胞的百分比和MFI。B类和C类，预先用抗DC-SIGN抗体阻断可减少gp120诱导的紧密连接蛋白的下调。在添加gp120之前，使用抗-DC-SIGN抗体处理细胞JRFL公司如上所述检测ZO1、Claudin-5、Occludin和JAM-2的表达。总结并展示了三个重复的数据线指示平均值(C类). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.天，Gp120诱导在共聚焦显微镜下观察到的紧密连接蛋白的破坏。用HIV-1 gp120糖蛋白或培养基在37℃下处理ARPE-19细胞（有或没有DC-SIGN敲除）48小时。用特异性抗体免疫染色后，在共焦显微镜下观察ZO-1和Occludin的表达。细胞核用DAPI染色。
图4。
图4。
gp120与DC-SIGN的结合诱导MMP表达，下调紧密连接蛋白。 A类，MMPs和细胞因子/趋化因子的诱导。用重组gp120糖蛋白处理ARPE-19细胞6小时，通过半定量RT-PCR在mRNA水平上检测MMP2、MMP9、TNF-α、ICAM-1、IL-8和CCL-2的表达，并用GAPDH进行标准化。B–D类先前用抗DC-SIGN抗体或DC-SIGN基因敲除阻断MMPs的诱导。ARPE-19细胞或DC-SIGN敲除细胞在与gp120孵育前，用抗DC-SIGN抗体预处理或不预处理1h。采用半定量RT-PCR和Western blotting检测MMP2和MMP9的表达。E类MMP抑制剂治疗可消除紧密连接蛋白的下调。ARPE-19细胞在加入或不加入MMP抑制剂GM6001预处理1h后再与gp120进一步孵育48h，并用流式细胞仪分析ZO-1、Claudin-5、Occludin和JAM-2的表达。总结并呈现了三个或四个重复的数据线指示平均值。数据为平均值±S.D(A类,B类、和天). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.M.W.公司。，分子量。
图5。
图5。
Gp120激活细胞NF-κB通路诱导MMPs。 A类ARPE-19 DC-SIGN敲除细胞在加入或不加入NF-κB抑制剂PDTC的情况下预处理1h，然后再与gp120进一步孵育4h，并用Western blotting监测IKKα、p-IKK a-β、IκB、MMP2和MMP9的表达。B类和C类MMP2、MMP9和细胞因子或趋化因子的表达通过半定量RT-PCR在mRNA水平定量，并用GAPDH标准化。数据为平均值±S.D。M.W.公司。，分子量。***，第页< 0.001.
图6。
图6。
HIV-1 gp120导致RPE屏障的破坏并增加通透性。ARPE-19细胞接种在Millicell插入物上生长形成单层。在细胞培养的最后2天，用或不用重组HIV-1 gp120糖蛋白处理单层细胞。一些样品在与gp120孵育之前用抗DC-SIGN抗体或GM6001预处理。A类，测量TEER值。B类，评估FITC-右旋糖酐通量的细胞旁通透性。日期代表平均值±S.D.*，第页< 0.05; **,第页<0.01；***，第页< 0.001. Ω，欧姆。
图7。
图7。
HIV-1 gp120与DC-SIGN结合可诱导人原代RPE细胞中MMPs的表达。 A类HRPEpiC细胞上DC-SIGN和HIV-1受体的表达。用特异性抗体对细胞进行免疫染色，并用流式细胞仪进行分析。显示阳性细胞的百分比。B类和C类，预先用抗DC-SIGN抗体阻断可减少gp120结合。用抗DC-SIGN抗体处理HRPEpiC细胞1h，然后在4°C下将gp120加载1h，再用小鼠抗gp120抗体对细胞进行免疫染色，然后用二级抗鼠IgG-FITC进行免疫染色。用流式细胞术分析细胞。显示阳性细胞的百分比和MFI。天之前用抗DC-SIGN抗体阻断MMPs的诱导。HRPEpiC细胞在与gp120孵育前，用或不用抗DC-SIGN抗体预处理1h。Western blotting检测MMP2和MMP9的表达。Iso标准，同型；M.W.公司。，分子量。
图8。
图8。
gp120 DC SIGN相互作用的示意图，其下调紧密连接蛋白并诱导血视网膜屏障的破坏。HIV-1 gp120糖蛋白与人类RPE细胞上表达的DC-SIGN分子结合。这种结合触发细胞NF-κB信号传导以诱导MMPs，MMPs随后介导紧密连接蛋白的降解，从而破坏BRB的完整性。
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