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.2016年9月14日；138(36):11996-2002.
doi:10.1021/jacs.6b07977。 Epub 2016年9月1日。

非酶RNA引物延伸中的高活性咪唑啉桥联二核苷酸中间体

丘比斯·瓦顿 1, 杰克·W·绍斯塔克 1
附属公司

非酶RNA引物延伸中的高活性咪唑啉桥联二核苷酸中间体

丘比斯·瓦顿等。 美国化学会志. .

摘要

由于其对生命起源的重要性，RNA模板的非酶复制几十年来一直是研究的热点。先前使用5'-磷酰基-2-甲基咪唑活化核苷酸（2-MeImpNs）作为底物的模板定向引物延伸的特征假定了一种经典的顺式亲核取代机制，其中引物的3'-羟基攻击进入单体的磷酸盐，取代2-甲基咪唑离开基团。然而，我们发现，引物延伸的初始速度取决于在引物延伸反应之前保持活化单体的pH值和浓度。这些和其他结果表明了另一种机制，即两个单体相互反应形成咪唑啉桥联二核苷酸中间体，然后与模板结合。引物的3'-羟基随后的攻击取代了活性核苷酸作为离开基团，导致引物延伸一个核苷酸。NMR对单体溶液的分析表明，所提议的咪唑啉桥联二核苷酸以预期的pH依赖方式形成。我们使用合成方法制备了富含该中间体的材料，并表明它是一种用于引物延伸的高活性底物。咪唑啉桥联二核苷酸中间体的形成为之前观察到的位于引物延伸位点下游的活性核苷酸的催化作用提供了一种机械解释。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
的速率底漆延伸率随时间增加或减少，具体取决于单体储备溶液的pH值。（a） 底漆延伸分析测量RNA引物模板中引物的比率双链通过非酶反应转化为较长延伸产物含2-MeImpN单体(1). （b） 使用2-MeImpG原料pH 9.88时k个光突发事件底漆延伸率随着时间的推移而增加。（c） 使用pH 7.79的2-MeImpG原料k个光突发事件引物延伸率随时间而降低。误差条指示±一个SD。
图2
图2
底漆初涂速度取决于pH值和浓度2-MeImpN储备溶液。（a） 最快的底漆初始速度在pH 6.8–7.0下预孵育的2-MeImpN溶液发生扩展。（b） 2-MeImpG的2-甲基咪唑基团先前已测定第页K（K）一pH值为7.09±0.20。（c） 用于测定的代表性凝胶图像50引发引物延伸反应的初始速率mM 2-MeImpC原料，pH值为10或7。（d） 底漆初始延伸率取决于2-MeImpC储备溶液和培养液的浓度pH值为7的时间。k个光突发事件在确定零点时使用pH值为10.4的2-MeImpC原料。误差条显示±1标准偏差。
图3
图3
观察推测的双鸟苷中间体的核磁共振信号2a个中性pD。（a）2-MeImpG的拟议反应(1a个)阴离子和两性离子生成双鸟苷中间体2a个和游离2-甲基咪唑(三). H（H）国际医学会代表芳香族2-甲基咪唑氢。H1′，H8和H国际医学会通过以下方式观察1核磁共振氢谱。（b）31P（161兆赫）和（c）1的H（400MHz）NMR光谱50 mM 2-MeImpG在pD 7.06下培养55至60分钟。信号来自GMP的以绿色突出显示，来自2-MeImpG的以黑色突出显示，以及来自蓝色2-甲基咪唑。推测1,3-二-GMP-2-甲基咪唑信号以红色突出显示。参考31P核磁共振波谱包含在支持信息（国际单位制）。
图4
图4
描述预测的咪唑啉桥联二核苷酸在浓缩材料中。（a） 部分纯化的材料会迅速腐烂进入CMP和2-MeImpC。31CMP的P NMR（161 MHz）峰值以绿色突出显示，2-MeImpC以黑色突出显示，双氰胺-5′，5′-焦磷酸灰色的（CppC）和推测的咪唑啉桥联二核苷酸红色。通过添加标准物确定CMP和2-MeImpC。时间从D中富集物质的再悬浮开始2O.（b）拟议中间体、CMP、CppC和2-MeImpC的量化随着时间的推移1核磁共振氢谱。（c） 引发底漆延伸反应使用部分纯化材料的速度很快它在反应中的作用。在模板上未观察到底漆延伸非补体胞苷。（d）13C核磁共振（100 MHz）富集后的物质在151.0ppm处识别出一个新的三重态（红色）对应于咪唑啉桥接结构。双人床（黑色）148.3 ppm对应于2-MeImpC的2-甲基咪唑基C2单体。
图5
图5
咪唑啉桥结构预测的影响13核磁共振C2处的碳同位素标记光谱。（a） 部分化学结构显示活化单体的位置13C类同位素标记天然丰度的两个键31P（P）原子。（b） 咪唑啉桥的部分化学结构显示那个13C同位素标签将被两个等效物分开31P原子。（c）1350的C核磁共振（100 MHz）谱百万分之一13C同位素标记2-MeImpC，pD 8.49。（d）1350 mM的C核磁共振（100 MHz）谱13C同位素标记2-MeImpC，pD 6.93。插图显示了151.0处观察到的三重态ppm。（e）3150 mM 2-MeImpC的P NMR（161 MHz）谱pD 7.02的同位素标记。（f）31P核磁共振（161 MHz）谱50 mM13C同位素标记2-MeImpC，pD 6.93。峰值来自2-MeImpC的以黑色突出显示，来自双氰胺中间体红色。
图6
图6
提议的机制咪唑啉桥联引物延伸二核苷酸。（a） 咪唑啉桥联二核苷酸中间体，其中N=G（红色）通过Watson–Crick base绑定模板与底物的3′羟基配对并反应形成延伸产品，底漆+1。（b） 除了底漆+1产品，此反应也再生活化的G单体。
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