Inhibition of HIF-prolyl-4-hydroxylases prevents mitochondrial impairment and cell death in a model of neuronal oxytosis

doi:10.1038/cddis.2016.107

.2016年5月5日；7（5）：e2214。

doi:10.1038/cddis.2016.107。

抑制HIF-脯氨酰-4-羟化酶可预防神经元氧中毒模型中的线粒体损伤和细胞死亡

S奈特梅尔¹, A M多尔加¹, B洪拉特¹, S S Karuppagounder公司^2 三, I Alim（阿利姆）^2 三, R R拉坦^2 三, C卡尔姆塞¹

附属公司

¹德国马尔堡生物化学与制药研究所、马尔堡中心生物化学与医药研究所、法赫布雷奇制药公司、马尔堡菲利普斯大学、卡尔冯·弗里施特拉1号，马尔堡35032。
²伯克-康奈尔医学研究所，美国纽约州怀特普莱恩斯。
^三美国纽约州康奈尔大学威尔医学院神经病学和神经科学系菲尔家族大脑和心智研究所。

PMID： 27148687
预防性维修识别码：项目经理4917646
DOI（操作界面）： 10.1038/cddis.2016.107

抑制HIF-脯氨酰-4-羟化酶可预防神经元氧中毒模型中的线粒体损伤和细胞死亡

S奈特梅尔等。细胞死亡病. 2016.

.2016年5月5日；7（5）：e2214。

doi:10.1038/cddis.2016.107。

作者

S奈特梅尔¹, A M多尔加¹, B荣誉¹, S S Karuppagounder公司^2 三, I Alim（阿利姆）^2 三, R R拉坦^2 三, C卡尔姆塞¹

附属公司

¹德国马尔堡生物化学与制药研究所、马尔堡中心生物化学与医药研究所、法赫布雷奇制药公司、马尔堡菲利普斯大学、卡尔冯·弗里施特拉1号，马尔堡35032。
²伯克-康奈尔医学研究所，美国纽约州怀特普莱恩斯。
^三美国纽约州纽约市康奈尔大学威尔医学院神经病学和神经科学系菲尔家族大脑和心理研究所。

PMID： 27148687
预防性维修识别码：项目经理4917646
DOI（操作界面）： 10.1038/cddis.2016.107

摘要

氧化应激诱导的线粒体损伤是神经退行性疾病病理学中神经元内固有细胞死亡途径的主要特征。因此，保护线粒体完整性和功能正在成为预防神经元损伤的一种有希望的策略。在此，我们表明，adataquin对低氧诱导因子脯氨酰-4-羟化酶（HIF-PHD）的药理抑制抑制脂质过氧化，并通过恢复线粒体膜电位和ATP生成，减少线粒体活性氧（ROS）的形成，充分维持线粒体功能并保护线粒体呼吸，从而在谷氨酸诱导的氧中毒模型中保护神经元HT-22细胞。使用CRISPR/Cas9技术选择性降低PHD1蛋白还可以减少HT-22细胞中的脂质过氧化和线粒体损伤，并减轻谷氨酸毒性。激活转录因子4（ATF4）表达水平和相关靶基因的调节可能介导这些有益的作用。总的来说，这些结果表明HIF-PHD是保护线粒体，从而保护神经元免受氧化细胞死亡的有希望的靶点。

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数字

图1
CRISPR/Cas9沉默PHD1可减轻氧中毒。(一)通过western blot分析验证了CRISPR/Cas9对PHD1的选择性敲除。(b条)四个独立的western blot定量显示PHD1蛋白水平降低。(**c（c）**)MTT分析显示，与WT细胞相比，CRISPR/Cas9（克隆2.17和5.18）对PHD1下调的保护作用可对抗谷氨酸毒性（5 mM，16 h）。数据以平均值±S表示。D(n个=8).^###*P（P）*与未经处理的WT对照组相比<0.001***P（P）*<0.01和****P（P）*与谷氨酸处理的WT对照组相比<0.001（ANOVA，Scheffés检验）。(d日)xCELLigence实时测量：与WT细胞相比，CRISPR/Cas9（克隆2.17和5.18）下调PHD1显示了对7 mM谷氨酸（glut）处理的保护作用

图2
CRISPR/Cas9沉默PHD1可恢复线粒体功能并阻止ROS的形成。(一)细胞用BODIPY 581/591染色，这是一种亲脂性荧光染料，在自由基氧化后会从红色荧光发射转变为绿色荧光发射，因此与脂质过氧化物的形成有关。谷氨酸处理15h（7mM）后，通过FACS分析检测荧光变化。克隆2.17和5.18显示，与WT对照细胞相比，脂质过氧化物生成显著减少(n个=4). (b条)通过线粒体SOX染色和FACS分析检测线粒体ROS生成。谷氨酸处理（7 mM，15.5 h）导致活性氧生成增加。CRISPR/Cas9下调PHD1（克隆2.17和5.18）减少了这种增加。的MitoSOX荧光定量n个=4个独立实验。数据显示为平均值±S。D。^###*P（P）*与未经处理的WT对照组相比<0.001****P（P）*与谷氨酸处理的WT对照组相比<0.001（ANOVA，Scheffés检验）。(**c（c）**)典型的FACS图显示，在谷氨酸暴露（6 mM，15.5 h）后，通过CRISPR/Cas9（克隆2.17和5.18）下调PHD1，TMRE荧光测量的MMP得以恢复。(d日)用谷氨酸（7 mM）处理15.5小时后，测量ATP水平。通过CRISPR/Cas9（克隆2.17和5.18）沉默PHD1可防止谷氨酸诱导的ATP耗竭(n个=8). 数据显示为平均值±S。D。^###*P（P）*与未经处理的WT对照组相比<0.001****P（P）*与谷氨酸处理的WT对照组相比<0.001。（方差分析，舍夫检验）

图3
PHD抑制剂可防止氧中毒。(一)光学显微镜照片显示谷氨酸处理的（5mM，15小时）HT-22细胞的形态学改变。AQ（2）共处理μM）完全阻止这些更改。比例尺：50μ米(b条)xCELLigence实时阻抗测量显示AQ的剂量依赖性有益作用(n个=6). (**c（c）**)在处理后条件下，根据xCELLigence记录（补充图3b，右黑色箭头）在15.5小时的时间点进行条形图评估(n个=6).^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001**P（P）*<0.05和****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001（ANOVA Scheffés检验）。(**d–f日**)MTT分析显示不同浓度DFO的保护作用(d日)，DHB(**e（电子）**)和CPO(**（f）**)防止谷氨酸诱导的（7 mM，16 h）氧中毒(n个=8). 数据以平均值±S表示。D。^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001（ANOVA Scheffés检验）

图4
AQ保护线粒体呼吸。(一)OCR测量显示AQ（2）恢复了基础呼吸和最大呼吸μM）谷氨酸暴露后（4 mM，15 h）。(b条)ATP生成的量化(一)A段（浅灰色）和B段（白色）的平均OCR之差表示谷氨酸暴露后ATP损失。AQ防止ATP水平下降(n个=6). 数据以平均值±S表示。D。^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001（ANOVA Scheffés检验）。(**c（c）**)谷胱甘肽（GSH）的测定表明，谷氨酸暴露（5 mM）后谷胱甘苷迅速下降，而AQ（2μM）

图5
PHD抑制剂保护线粒体功能，防止线粒体和脂质过氧化物的生成。(一)DFO（20μM），DHB（20μM）和CPO（2μM）通过BODIPY染色和随后的FACS分析，消除谷氨酸诱导的（7 mM，15 h）脂质过氧化物的形成。数据以平均值±S表示。D(n个=4).^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001（ANOVA Scheffés检验）。(b条)DFO（20μM），DHB（20μM）和CPO（2μM）防止谷氨酸处理后线粒体活性氧的生成（7 mM，15 h）。数据以平均值±S表示。D。^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001（ANOVA Scheffés检验）。(**c（c）**)不同浓度的DFO、DHB和CPO可防止谷氨酸诱导的（7 mM，15 h）ATP损失。数据以平均值±S表示。D(n个=8).^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001；ANOVA Scheffé测试。(d日)DFO（20μM），DHB（20μM）和CPO（2μM）充分防止谷氨酸激发后（7 mM，15 h）基质金属蛋白酶的破坏。数据以平均值±S表示。D(n个=4).^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001；ANOVA Scheffé测试。(**e（电子）**)谷氨酸暴露后（4 mM，15 h）OCR的测量显示基础呼吸和最大呼吸降低，这是DFO所禁止的（20μM），DHB（20μM）和CPO（2μM）分别为

图6
AQ显示出较小的抗氧化性能。(一)DCF染色显示在谷氨酸盐（4mM）激发6小时后形成可溶性ROS。AQ（2）共处理μM）降低可溶性ROS。(b条)DCF荧光定量n个=3个独立实验，如(一). 数据显示为平均值±S。D。^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比<0.001；方差分析，舍夫检验。(**c（c）**)MTT分析显示AQ对H的剂量依赖性保护作用₂O（运行）₂-诱导细胞死亡（16h）。数据显示为平均值±S。D(n个=8).^###*P（P）*与未经治疗的对照组相比<0.001****P（P）*与各自的H相比<0.001₂O（运行）₂-处理对照；（ANOVA，Scheffés tes）

图7
AQ调节ATF4的表达。(一)四个独立实验的代表性蛋白质印迹和相应的定量显示，在谷氨酸4小时后ATF4上调，在14小时后下调，这被AQ恢复。^#*P（P）*与经谷氨酸处理的对照组相比，<0.05。(b条)四个独立实验的代表性蛋白质印迹和相应的定量显示，谷氨酸4小时后xCT上调，14小时后下调，AQ恢复**P（P）*<0.05和***P（P）*与未经治疗的对照组相比，<0.01。(**c（c）**)典型的western blot和相应的定量分析表明eIF2的磷酸化状态没有显著变化α谷氨酸激发或AQ治疗

图8
ATF4沉默不会削弱AQ介导的保护。(一)通过AV/PI染色和随后的FACS分析，典型点图显示谷氨酸激发后（6 mM，25 h）细胞死亡。(b条)图中AV-和AV/PI阳性细胞的定量(一) (n个=3). 数据显示为平均值±S。D。^###*P（P）*与未经处理的siScr相比<0.001****P（P）*与谷氨酸处理的siScr相比<0.001（ANOVA，Scheffés test）。(**c（c）**)DCF染色定量显示ATF4基因沉默后可溶性ROS的时间依赖性形成。数据显示为平均值±S。D类(n个=4). ****P（P）*与相应车辆相比<0.001。(d日)DCF染色和随后的FACS分析显示，AQ共处理可防止ATF4敲除后可溶性ROS的生成。数据以平均值±S表示。D(n个=3).^###*P（P）*<0.001，与各自未经治疗的车辆相比****P（P）*与各自未经治疗的siATF4相比<0.001

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