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比较研究
.2016年5月；15(5):1622-41.
doi:10.1074/mcp。M116.058354。 Epub 2016年2月24日。

通过定量靶向MS捕获细胞状态测量的代表性减少的磷信号并实现药物诱导表型的大规模比较

詹妮弗·阿别林 1, 吉纳尔·帕特尔 1, 陆晓东 1, 凯特琳·M·费尼 1, 洛拉·法格巴米 1, 阿曼达·L·克里奇 1, 胡靖宇 1, 林小明 1, 德西里·戴维森 1, 林赛·皮诺 1, 贾纳·W·乔 1, 埃里克·库恩 1, 亚当警官 1, 李建学 2, 苏珊·阿巴蒂埃洛 1, Aravind Subramanian语 1, 理查德·西德曼 2, 伊万·施耐德 三, 史蒂文·卡尔 1, 雅各布·D·杰菲 4
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比较研究

通过定量靶向MS捕获细胞状态测量的代表性减少的磷信号并实现药物诱导表型的大规模比较

詹妮弗·阿别林等。 分子细胞蛋白质组学. 2016年5月.

摘要

分析翻译后修饰是表征细胞过程的基因表达数据的另一个维度。许多细胞对药物的反应是由细胞磷酸化信号的改变介导的。我们试图开发一个通用平台，在该平台上可以在数千个样本中分析磷酸信号反应，并创建了一种靶向MS分析，该分析分析了一组减少代表性的磷酸肽，我们发现这些磷酸肽是对化学扰动反应的强指标。为了开发该检测方法，我们研究了来自三种细胞系的样品中磷酸化位点的协同调节，这些细胞系分别用26种不同的生物活性小分子处理。通过聚类并从每个聚类中选择1到2个代理成员，从这些发现研究中选择磷酸肽分析物。开发了一种定量、有针对性的平行反应监测分析方法，用于直接测量96个还原-再呈现探针。蛋白质水解消化、蛋白质定量、肽脱盐和磷酸肽富集的样品处理已实现全自动化，使得在3天内同时处理96个样品成为可能，磷酸肽富集方差为12%。这一高度可重复的过程允许在约200个样品中检测到约95%的还原再呈现磷酸肽探针。通过测量在发现实验的处理条件下产生的新样品中的探针来评估分析性能，并使用分析工作量的一小部分重述了更深入实验的观察结果。我们在不同处理、细胞类型和时间点的新实验中测量了这些探针，以证明其通用性。我们证明，该分析对常见信号通路（例如MAPK、PI3K/mTOR和CDK）的中断敏感。高通量、减少再表达的磷酸蛋白组学分析为在一系列生物条件下比较扰动提供了一个平台，适用于分析数千个样本。我们相信，通过比较磷酸蛋白质组特征，该分析将被证明对已知和新药物以及遗传机制的分类非常有用。

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数字

图1。
图1。
用于识别还原再表达磷酸蛋白质组探针的大规模转录和磷酸蛋白质组分析数据。 A类，描述P100分析发展的示意图。选择以多效性方式调节磷酸化的药物治疗，并从使用这些药物治疗的多种细胞类型中收集大规模的全球磷酸化数据。从这些数据中确定了具有代表性的磷酸肽探针，并用于配置P100分析。通过对来自多种生物背景的样品进行分类和分层，证明了P100分析的功能性。然后使用P100数据确定样本之间的关联。B类从CMap数据库中提取与注释为激酶或磷酸酶的基因相对应的Affymetrix基因表达水平，并进行聚类（为清晰起见，省略了树状图）。结合具有类似激酶/磷酸酶基因表达谱的细胞/化合物处理进行了说明，并通过上述“运行平均值”图总结了具有类似谱的组。箭头表示强烈协调的样本组。C类描述了大规模发现实验的工作流程。细胞在SILAC培养基中生长，裂解、消化、分馏，并使用高分辨率UPLC-MS进行分析。D类，显示了一个聚集的热图，表示在所有MS实验中存在的超过75%的1200个常见观察到的磷位点。具有配位活性的磷脂酶组沿着垂直轴聚集在一起，而样品沿着水平轴聚集（为了清楚起见，省略了树状图）。补充数据集1中提供了该图的基础数据。
图2。
图2。
不同的化合物处理在发现数据中产生独特的磷酸标记。大规模发现热图的选定区域（图1D类)如图所示。A类，无论是何种细胞系（MCF7、PC3或HL60），紫杉醇处理的细胞的磷酸化信号都聚集在一起，并且显示了跨不同蛋白质组的几个磷酸化位点的上调。两种血统依赖(B类)和特定血统的签名(C类)通过一组心肌糖苷结构类似物（地高辛、地高辛原、地高糖原和毛苷(C类)如图所示。D类，一组磷脂酶，似乎在不同的条件下受到协调调节。这些位点的亲本基因对染色质功能有强烈的偏见。E类染色质结合簇中8个亲本基因中的7个参与蛋白质相互作用的紧密网络。
图3。
图3。
P100自动化样本处理、路径覆盖和数据分析管道。 A类，自动化P100样品处理示意图。第一天，细胞被溶解，进行蛋白质定量并稀释至均匀浓度。然后蛋白质被还原、烷基化和消化。第二天，使用96 well设备对样品进行脱盐，并干燥过夜。第三天，通过IMAC富集磷酸肽并脱盐。最后，使用高分辨率UPLC-HCD MS/MS对样品进行分析。B类图中显示了由用于识别还原再表达磷酸肽探针组的较大磷酸肽组表示的顶部信号通路。每个信号通路被描述为一个圆圈，其大小表示特定通路中涉及的源蛋白的数量。更大的尺寸表明信号通路由更多的磷酸肽表示。每条通路的颜色仅表示所代表的信号通路的多样性。C类，显示了P100分析的数据分析管道。数据以96-well板格式收集，在Skyline中进行分析，并导出以进行汇总。去除磷酸肽探针和样本异常值，并对轻/重肽比率进行标准化。对质量控制数据进行了层次聚类，揭示了不同扰动下的分子特征。
图4。
图4。
简化表示P100数据重述了大规模发现数据。P100简化表示验证数据集。A类，在与初始大规模磷酸蛋白质组学实验相同的条件下生成的样品中生成的P100磷酸剖面的热图。在大规模数据中观察到的许多相同的样本关联可以通过减少再表达P100分析发现。蓝盒子：生物复制物和结构相关化合物紧密聚集在一起，如地高辛、地高辛和毛蕊苷C处理所示。绿色方框：GW8510处理的磷蛋白在细胞系间聚集，同时保留一些细胞系特异性反应。B类，总结非自身（用一种化合物处理一种细胞类型的样本，与所有其他细胞系和治疗组合进行比较）、跨细胞系的相同药物治疗（同一药物的所有生物复制品在两个不同细胞系中进行比较）之间的成对相关性，并且显示了每个细胞系中的相同药物治疗（同一药物的所有生物复制品在单个细胞系中进行比较）。
图5。
图5。
P100分析中的特征强度具有剂量响应性。 A类，热图显示了用不同剂量的激酶抑制剂staurosporine（0.5–20 m）处理细胞（MCF7，PC3）后，P100探针子集产生的浓缩特征米)如图所示。对增加的星形孢菌素剂量反应减少的磷酸肽探针的实例（簇1和图谱(B类)以及随着剂量增加而增加的探针（簇2和轮廓(C类)已观察到。
图6。
图6。
P100在胚胎干细胞（ESC）和神经前体细胞（NPC）中产生分子标记，以响应多种复合治疗。热图显示了使用不同类别的表观遗传学活性药物（包括Brd4抑制剂、EZH2抑制剂和HDAC抑制剂）治疗ESC和NPC时的磷酸化信号特征。正如P100验证实验中观察到的那样，相同药物治疗的复制品在每个细胞类型内聚集在一起。此外，如Brd4抑制剂JQ1所示，NPC和ES中相同治疗簇的分子特征。上述细胞类型和任何药物治疗（MS-275除外）均未用于P100分析的开发。
图7。
图7。
P100的时间分辨特征揭示了生物重要信号通路的模块性。 A类，通路重建显示了一组已知抑制关键信号通路中重要节点的药物的靶点。对MCF7细胞给予这些药物3、6和24小时。B类，P100分子特征，来自药物处理过的样品。未对样本进行聚类，但已对P100探针（行）进行聚类（树状图省略）。在对应于一种药物的每一个主要列中，每个样品的个人简介都是按照时间点从左到右排序的。C类，对比同一时间点样本轮廓的轮廓相关矩阵。所示边界旨在提请注意非对角相邻相关性的丰富。这些边界恰好对应于重建路径中的模块，并由路径模块着色，如图7所示A类.
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